沉水植物生態(tài)修復(fù)對(duì)西湖細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響*

李琳琳，湯祥明，高 光，邵克強(qiáng)，龔志軍，陳 丹，張?jiān)迫A

(1:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036)

(2:中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008)

近年來，湖泊富營(yíng)養(yǎng)化已成為世界范圍內(nèi)一個(gè)突出的環(huán)境問題[1-3].隨著富營(yíng)養(yǎng)化的加劇，湖泊中常暴發(fā)藻類水華，水生植物急劇減少，甚至消失.而大型水生植物，特別是沉水植物，能吸收利用水體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，合成自身生長(zhǎng)發(fā)育所需要的物質(zhì)，有效地降低水體中的營(yíng)養(yǎng)鹽濃度，同時(shí)與藻類競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)鹽，抑制“藻華”的暴發(fā).因此，沉水植物的恢復(fù)往往是湖泊富營(yíng)養(yǎng)化修復(fù)的主要措施之一[4-6].

在水生態(tài)系統(tǒng)中，微生物是極為敏感并易受環(huán)境影響的生物類群.它們不僅是系統(tǒng)中生物量的重要組成部分，而且影響著物質(zhì)循環(huán)和營(yíng)養(yǎng)傳遞過程[7].鑒于細(xì)菌在水生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用及其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的變化反應(yīng)迅速等特點(diǎn)，在生態(tài)修復(fù)過程中，細(xì)菌的豐度、群落結(jié)構(gòu)及多樣性等的變化可以作為評(píng)判生態(tài)修復(fù)效果的重要指標(biāo)[8-9].

杭州西湖是我國(guó)著名的風(fēng)景旅游湖泊，也是一個(gè)淺水型城市富營(yíng)養(yǎng)化湖泊，水域面積5.6 km2，平均水深僅1.56 m.湖水的總氮(TN)和總磷(TP)分別為2.204 和0.125 mg/L，平均透明度僅為46 cm[10].經(jīng)過一系列整治工程后，水質(zhì)得到了一定程度的改善，如北里湖TN 和TP 分別為1.930 和0.041 mg/L，但湖泊富營(yíng)養(yǎng)化問題依然沒有解決[11].目前，關(guān)于西湖細(xì)菌的研究主要集中在對(duì)西湖水體及沉積物中可培養(yǎng)細(xì)菌方面[10，12-14]，但天然水環(huán)境中的微生物僅有0.001%～3%可以被分離培養(yǎng)[15]，利用傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)方法不能獲取水體中比較真實(shí)的細(xì)菌豐度信息，更無法了解特定生態(tài)修復(fù)措施是如何導(dǎo)致生境中微生物種群組成的變化.

近些年，隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，基于原核生物16S rRNA 基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)及克隆文庫(kù)等技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于湖泊生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)研究[16-21].湖泊生態(tài)修復(fù)研究表明，沉水植物可顯著改變水體中細(xì)菌的多樣性[22-23]，但沉水植物對(duì)水體中細(xì)菌群落組成的影響卻少有報(bào)導(dǎo).本文采用PCR-DGGE 和克隆文庫(kù)相結(jié)合的方法，研究了杭州西湖沉水植物生態(tài)修復(fù)對(duì)水體細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為富營(yíng)養(yǎng)化湖泊生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)機(jī)制提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣地點(diǎn)

為了改善西湖水質(zhì)，實(shí)施了以沉水植被恢復(fù)為主的生態(tài)修復(fù)工程.實(shí)驗(yàn)圍隔建在西湖北面的北里湖(30°15'26″N，120°8'16″E;圖 1)，由聚乙烯布圍成，共 6 個(gè)，每個(gè)圍隔 6 m 長(zhǎng)、4 m 寬、1.7 m 深.圍隔底部先鋪上竹排再加上西湖底泥，厚約40 cm.2011年1月在1#～3#圍隔種植菹草(Potamogeton crispus)，4#～6#圍隔撒播苦草(Vallisneria natans)塊莖(圖1).本次試驗(yàn)采樣點(diǎn)分別設(shè)在6 個(gè)圍隔(1#～3#圍隔記作菹草處理;4#～6#圍隔記作苦草處理)及圍隔外北里湖未進(jìn)行生態(tài)修復(fù)的湖區(qū)7#～9#(記作無草對(duì)照).4月底采樣時(shí)1#～3#圍隔菹草繁茂，株高約1.2 m，覆蓋度達(dá)到100%;4#～6#圍隔苦草長(zhǎng)出約15 cm，覆蓋度約為50%.

圖1 杭州西湖生態(tài)修復(fù)工程位置、圍隔設(shè)置及采樣點(diǎn)Fig.1 Location of ecological restoration project，design of enclosures and sampling sites in West Lake，Hangzhou

1.2 樣品的采集及處理

于2011年4月29日，用采水器采集每個(gè)圍隔內(nèi)及對(duì)照點(diǎn)的表層水樣(水下約50 cm 處)各5 L.水樣分成3 個(gè)部分:(1)取250 ml 水樣，現(xiàn)場(chǎng)用手持式真空泵于0.2 μm 孔徑的聚碳酸酯濾膜上過濾，然后用滅過菌的離心管收集濾膜，置于-20℃保存，一周內(nèi)進(jìn)行DNA 提取及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析.(2)另取46 ml水樣裝入滅過菌的離心管中，管中預(yù)先加入了用0.2 μm 孔徑的濾膜過濾后的無顆粒甲醛溶液4 ml(甲醛的終濃度為2%V/V，體積比)，樣品置冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置冰箱4℃保存，一周內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌豐度測(cè)定.(3)其余水樣置于預(yù)先洗凈的塑料桶中送到實(shí)驗(yàn)室直接用于水樣化學(xué)及生物指標(biāo)分析.

1.3 理化參數(shù)的測(cè)定

采樣點(diǎn)水體的透明度(SD)用透明度盤現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定.水深用便攜式測(cè)深儀(奧地利UWITEC 公司)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定.水溫、pH、溶解氧(DO)、濁度及葉綠素a(Chl.a)的含量用多參數(shù)水質(zhì)測(cè)定儀(YSI6600V2，USA)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量.總磷、總氮、溶解性總氮(DTN)、溶解性總磷(DTP)含量的分析參照《湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范》[24].懸浮物含量(SS)為水樣經(jīng)Whatman GF/F 膜過濾后將濾膜在105℃烘干4 h 至恒重后的質(zhì)量[24];稱重后的濾膜放入馬弗爐，在550℃下灼燒3 h 至恒重后再次稱重，兩次質(zhì)量之差即為懸浮物中有機(jī)質(zhì)的含量.

1.4 細(xì)菌計(jì)數(shù)

采用DAPI 染色后表面熒光顯微鏡直接計(jì)數(shù)的方法[25].將上述甲醛固定的水樣用無菌水稀釋一定倍數(shù)，用核酸染料DAPI 染色，于表面熒光顯微鏡在16×100 放大倍數(shù)下觀察計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品不少于20個(gè)視野，再將視野里的細(xì)菌個(gè)數(shù)轉(zhuǎn)換成每毫升細(xì)菌數(shù)，即為細(xì)菌豐度.

1.5 DNA提取及PCR-DGGE分析

水樣細(xì)菌總基因組DNA 的提取參照Zhou 等的方法[26].采用針對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，正向引物是341f(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')，引物的5'端連有一個(gè)40 bp 的GC 夾;反向引物為 518 r(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')[16].PCR 采用 25 μl 反應(yīng)體系，組份為:10× PCR 緩沖液，25 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L 引物，1.0 U Taq 酶(Takara)和 1 μl 模板 DNA，加無菌水補(bǔ)足至25 μl.PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 公司的熱循環(huán)儀(Applied Biosystems VeritiTMThermal Cycler)中進(jìn)行，采用降落PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65 ～53℃(每個(gè)循環(huán)溫度下降1℃)退火30 s，72℃延伸30 s，13 個(gè)循環(huán);采用53℃的退火溫度再進(jìn)行21 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min.PCR 結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定片段大小，用圖像分析軟件拍照分析.

變性梯度凝膠電泳使用美國(guó)CBS 公司電泳儀(DGGE-2001)進(jìn)行，使用8%的聚丙烯酰胺變性膠(丙稀酰胺∶雙丙稀酰胺=37.5∶1)，變性梯度為40%～60%(100%變性膠含有7 mol/L 尿素和40%去離子甲酰胺).電泳緩沖液為1× TAE(20 mmol/L Tris，10 mmol/L acetate，0.5 mmol/L EDTA，pH 8.0).60℃恒壓100 V，電泳16 h.DGGE 膠用SYBR GREEN I(1∶10000 稀釋)染色15 ～30 min，采用Omega10TM全自動(dòng)多功能凝膠成像分析系統(tǒng)拍照.

1.6 樣品的克隆建庫(kù)

根據(jù)DGGE 結(jié)果，選擇1#、4#、7#樣品克隆建庫(kù)，使用細(xì)菌通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和 1492 r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')擴(kuò)增細(xì)菌的 16S rDNA.反應(yīng)體系(25 μl):2.5 μl 10× buffer，0.25 μl 模板 DNA，2 μl dNTP，各 0.3 μl 的引物和 0.4 μl Taq 聚合酶，無菌水補(bǔ)至 25 μl.使用降落 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，程序如下:94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性45 s，65 ～52℃(每循環(huán)下降0.5℃)退火45 s，72℃延伸90 s，24個(gè)循環(huán);采用52℃的退火溫度再進(jìn)行6 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min.將3 次PCR 產(chǎn)物混合后通過1%瓊脂糖凝膠電泳，割膠后純化，立即進(jìn)行TA 克隆，將純化后的PCR 產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy 載體(Promega)上，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top 10 感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建克隆文庫(kù).

1.7 測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

每個(gè)文庫(kù)隨機(jī)挑選100 個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成.所得序列使用BioEdit(version 7.0.9)剪切留取置信度最高的750bp 序列.利用RDP 在線程序Check-Chimera 對(duì)獲得的16S rDNA 序列片段進(jìn)行嵌合體(Chimera)檢驗(yàn)，并通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，去除嵌合體和葉綠體(Chloroplast)序列.將相似性高于97%的序列歸為同一個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，每一個(gè)OTU 中選擇代表性克隆子(3 個(gè)文庫(kù)中各選一個(gè))在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，選擇參比序列，然后使用MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis，version 5.0)軟件，根據(jù)Jukes-Cantor 算法計(jì)算進(jìn)化距離，用最小進(jìn)化距離法(ME 法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.進(jìn)化樹拓?fù)鋵W(xué)分析的置信值由1000 次隨機(jī)取樣后，經(jīng)最大簡(jiǎn)約分析(maximum parsimony analysis)計(jì)算所得.本研究所得到的248 個(gè)細(xì)菌16S rDNA 序列已上傳到GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為JX075268 ～JX075515.

1.8 數(shù)據(jù)處理

所得到的數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA)，以比較不同沉水植物生態(tài)修復(fù)與無草對(duì)照點(diǎn)間差異的顯著性.DGGE 結(jié)果用GelCompar II 軟件(Applied Maths，Kortrijk，Belgium)進(jìn)行分析，以獲得DGGE 條帶信息的矩陣，計(jì)算各樣品細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)，并進(jìn)行聚類分析.克隆文庫(kù)覆蓋度及多樣性指數(shù)等用軟件SPADE(Chao and Shen，http://chao.stat.nthu.edu.tw/softwareCE.html)進(jìn)行計(jì)算.文庫(kù)差異的顯著性通過Mothur 軟件(版本v1.24.0)中的∫-Libshuff 程序進(jìn)行比較[27].

2 結(jié)果

2.1 水質(zhì)參數(shù)

菹草處理、苦草處理與湖區(qū)無草對(duì)照之間pH 無顯著差異，均值為9.01;無草對(duì)照點(diǎn)平均水溫為23.47℃，分別比菹草處理和苦草處理低0.70 和1.40℃(圖2A).種植沉水植物顯著降低了水體的濁度和SS含量，使水體的透明度提高了82%，但顯著增加了水體中有機(jī)質(zhì)的比例(圖2B、C).種植沉水植物也顯著降低了水體中TP、TN 及DTN 的濃度，但對(duì)水體中DTP 的影響不大(圖2D、E).種植菹草和苦草均使水體中DO 濃度升高，但與無草對(duì)照組之間差異不顯著(圖2F).沉水植物的恢復(fù)顯著降低了水體中的Chl.a 的含量(圖2G).

2.2 細(xì)菌豐度

北里湖無草對(duì)照點(diǎn)細(xì)菌豐度均值為2.96×106cells/ml，種植菹草和苦草使細(xì)菌豐度分別降至2.27×106和2.51×106cells/ml，但三者間的差異未達(dá)到顯著水平(圖2H).

2.3 細(xì)菌PCR-DGGE分析

DGGE 結(jié)果顯示無草對(duì)照DGGE 條帶數(shù)均值為30 條，菹草處理和苦草處理的DGGE 條帶數(shù)均值分別為40 條和34 條，且菹草處理與無草對(duì)照相比差異顯著(圖2I).聚類分析表明在相似度為70%的水平上，無草對(duì)照、菹草處理和苦草處理細(xì)菌群落分別形成3 個(gè)明顯不同的類群(圖3).根據(jù)DGGE 結(jié)果計(jì)算出來的細(xì)菌多樣性指數(shù)也表明:種植菹草和苦草可顯著提高水體中細(xì)菌的Shannon 指數(shù)(圖2J).

2.4 克隆文庫(kù)的分析

3 個(gè)細(xì)菌16S rDNA 克隆文庫(kù)去除嵌合體序列及28 個(gè)來自硅藻門的Chloroplast 序列(均來自菹草處理的文庫(kù))后，共得到248 個(gè)有效序列，44 個(gè)OTU(表1).3 個(gè)文庫(kù)的覆蓋度在77.8% ～95.6%之間，說明文庫(kù)的代表性比較高.文庫(kù)的Chao1 指數(shù)數(shù)據(jù)表明，種植水草后水體中細(xì)菌種類的豐富度有所增加，但反映克隆文庫(kù)中OTU 的豐度、均勻度等的綜合指標(biāo)的Shannon 指數(shù)(H')變化趨勢(shì)不一(表1).∫-Libshuff 結(jié)果表明:種植菹草和苦草的處理組之間細(xì)菌群落差異不顯著，但兩者均與無草對(duì)照組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(表2).

表1 細(xì)菌克隆文庫(kù)多樣性比較Tab.1 Comparison of bacterial diversity and library coverage estimations in the clone libraries

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 西湖不同處理圍隔及湖區(qū)無草對(duì)照點(diǎn)主要的水質(zhì)及生物參數(shù)比較(數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差;不同字母表示同一指標(biāo)不同處理下差異顯著(P ＜0.05))Fig.2 Comparison of water quality and biological parameters among two kinds of ecological restorations and the control stations in West Lake

北里湖細(xì)菌由擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)中的 Alpha-、Beta-及 Gamma-proteobacteria 3 個(gè)綱組成.Bacteroidetes、Betaproteobacteria 和Verrucomicrobia 是3 個(gè)最主要的細(xì)菌門類，分別占到42.9%、30.8%和14.3%(圖4).種植菹草和苦草的圍隔中Bacteroidetes 所占的比例分別減少了30.2%和37.6%;Betaproteobacteria 所占的比例分別提高了21.6%和28.8%;Alphaproteobacteria 則由4.4%提高到19.0%和12.8%.種植菹草后Verrucomicrobia 的比例大幅降低，而種植苦草對(duì)Verrucomicrobia 的影響不大.此外，種植菹草的圍隔中Gammaproteobacteria 的比例提高了5.1%，并且浮霉菌門(Planctomycetes)的細(xì)菌也只發(fā)現(xiàn)存在于這種圍隔中.

圖3 不同處理圍隔中和湖區(qū)無草對(duì)照點(diǎn)細(xì)菌群落組成的DGGE 圖譜及聚類分析Fig.3 Bacterial community composition analyzed by DGGE profiles and cluster analysis of the samples

通過與已培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行序列相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)[28]，248 序列與已培養(yǎng)的細(xì)菌的相似性在82.2%～100%之間，其中相似性大于97%的序列占到50.4%.細(xì)菌16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，3 個(gè)文庫(kù)中共有70.2%(174 個(gè))的序列屬于15 個(gè)已知的典型淡水細(xì)菌類群[29-32]，如屬于Betaproteobacteria 的 Rhodoferax sp.BAL47、Li-UU-5-340.2、P.necessarius、PRD18A09 等;屬于Alphaproteobacteria 的 GOBB3-C201、LiUU-9-283.2等;屬于 Bacteroidetes 的 PRD01001B 等;屬于Verrucomicrobia 的 CL0-14 等(圖 5).其中屬于Rhodoferax sp.BAL47、CL0-14、GOBB3-C201 和PRD01001B 這4 個(gè)類群的細(xì)菌序列最多，分別為 77、30、24 和 22 個(gè).Rhodoferax sp.BAL47 類群的克隆子最相近的菌株是最近分離純化自捷克Rimov 水庫(kù)的兩個(gè)菌株Limnohabitans planktonicus II-D5T和Limnohabitans parvus II-B4T[33]，屬于其它3 個(gè)類群的克隆子沒有相似性大于97%的相應(yīng)菌株.

表2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性顯著性的∫-Libshuff 分析Tab.2 ∫-Libshuff comparisons of the heterogeneity of the three bacterial clone libraries

3 討論

3.1 沉水植物生態(tài)修復(fù)對(duì)水體中細(xì)菌多樣性的影響

氮、磷及有機(jī)碳等是細(xì)菌增殖的限制因素，通常氮、磷濃度的升高可促進(jìn)湖泊中細(xì)菌的增殖，但水體營(yíng)養(yǎng)鹽的過度升高也會(huì)造成沉水植物的消亡、微生物多樣性下降等生態(tài)環(huán)境的惡化，最終導(dǎo)致湖泊生態(tài)系統(tǒng)受損[34-37].本研究表明，種植沉水植物后水體中的細(xì)菌數(shù)量有所下降，但是細(xì)菌的DGGE 條帶數(shù)有所增加，并且表征細(xì)菌多樣性的Shannon 指數(shù)也顯著高于無草對(duì)照水域(圖2)，這與毛杰等研究的結(jié)果一致[23].

圍隔實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行菹草和苦草生態(tài)修復(fù)可顯著降低水體中TN、TP 濃度及Chl.a 的含量，同時(shí)降低水體的濁度及懸浮物的濃度，顯著提高水體的透明度(圖2)，使生態(tài)系統(tǒng)由以浮游植物為主的濁水態(tài)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐猿了参餅閮?yōu)勢(shì)的清水態(tài)系統(tǒng).沉水植物的生長(zhǎng)可吸收大量的營(yíng)養(yǎng)鹽，同時(shí)抑制沉積物中營(yíng)養(yǎng)鹽的釋放，而水體中氮、磷等營(yíng)養(yǎng)鹽的降低可能是導(dǎo)致圍隔中細(xì)菌豐度降低的主要原因.由于競(jìng)爭(zhēng)和化感作用，沉水植物可能抑制浮游植物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致處理組葉綠素含量遠(yuǎn)低于無草對(duì)照組，而浮游植物群落可以顯著影響浮游細(xì)菌的多樣性[30].其次，沉水植物的生長(zhǎng)增加了水體微環(huán)境的異質(zhì)性，為細(xì)菌提供更加多樣的生態(tài)位，這可能是生態(tài)修復(fù)后細(xì)菌多樣性增加的另一個(gè)主要原因.此外，種植沉水植物后水體中有機(jī)質(zhì)比例顯著高于湖區(qū)無草對(duì)照(圖2C)，這暗示沉水植物降低營(yíng)養(yǎng)鹽和浮游植物生物量的同時(shí)，自身釋放一定的溶解性有機(jī)碳(DOC).而研究表明DOC 對(duì)細(xì)菌群落及其多樣性有一定的調(diào)控作用[9，38].

圖4 不同沉水植物處理下細(xì)菌種類組成的百分比Fig.4 Relative abundance of bacterial phylogenetic groups in the studied clone libraries

3.2 沉水植物生態(tài)修復(fù)對(duì)水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

革蘭氏陽性菌Bacteroidetes(即以前的Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides，CFB)和革蘭氏陰性菌α-、β-proteobacteria 是富營(yíng)養(yǎng)化的淡水湖泊生態(tài)系統(tǒng)中最為豐富的細(xì)菌菌群.研究表明，沉水植物的存在可顯著改變水體中細(xì)菌的群落組成[20，39].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉水植物生態(tài)修復(fù)后水體中的Bacteroidetes 比例大為降低，而α-、β-proteobacteria 比例迅速上升(圖4).這種細(xì)菌類群比例的變化，主要表現(xiàn)為少數(shù)典型淡水類群中克隆子數(shù)量的增減和部分新OTU 的產(chǎn)生(圖5、6).例如，無草對(duì)照點(diǎn)湖水中屬于Bacteroidetes 的一個(gè)OTU(代表克隆子為:XH-4-B-80，共有21 個(gè)克隆子，圖5)就占到Bacteroidetes 中克隆子總數(shù)的53.8%，與此OTU 最相似的序列clone E4(HQ853002)來自富營(yíng)養(yǎng)化的洱海.而經(jīng)沉水植物修復(fù)后的水體中此OTU 的細(xì)菌幾乎消失.Bacteroidetes 數(shù)量的減少并伴隨α-和γ-proteobacteria 數(shù)量的增加可能是水質(zhì)改善的表現(xiàn)[40-41].

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化是其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)，也與其功能相一致.沉水植物修復(fù)可通過抑制沉積物再懸浮和抑制浮游植物的過度繁殖、釋放可溶性有機(jī)物等，改變局域水體的水質(zhì)，甚至生態(tài)系統(tǒng)的類型(濁水型轉(zhuǎn)變?yōu)榍逅?，最終也影響到水體中細(xì)菌的多樣性、群落組成及生態(tài)學(xué)功能.例如，湖泊中α-proteobacteria被認(rèn)為在低營(yíng)養(yǎng)鹽環(huán)境中更有競(jìng)爭(zhēng)力，并且它們有降解復(fù)雜有機(jī)復(fù)合物(可能來自沉水植物的釋放或降解)的能力，而Bacteroidetes 常與藻類釋放的有機(jī)物降解關(guān)系密切[30，42].雖然本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菹草和苦草對(duì)水體中細(xì)菌多樣性和細(xì)菌群落組成的影響不完全一致(圖4、5、6)，但是這有可能與實(shí)驗(yàn)時(shí)這兩種植物所處的生長(zhǎng)時(shí)期和覆蓋度不同有關(guān).采樣時(shí)菹草生長(zhǎng)已經(jīng)達(dá)到鼎盛期，覆蓋度達(dá)到了100%;而此時(shí)苦草剛處于生長(zhǎng)初期，覆蓋度也只有50%左右.不同種類的沉水植物或不同組合的沉水植物對(duì)水體中細(xì)菌的影響是否相同，仍需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以揭示.

綜上所述，沉水植物生態(tài)恢復(fù)不僅可以提高水質(zhì)，也可以提高水體中細(xì)菌的多樣性，改變水體中細(xì)菌的群落組成，使之向更加健康的方向發(fā)展.在控源截污的基礎(chǔ)上，進(jìn)行沉水植物生態(tài)恢復(fù)與維持，并配以適當(dāng)?shù)墓こ檀胧┖凸芾恚杉涌旌瓷鷳B(tài)修復(fù)進(jìn)程.

致謝:感謝朱廣偉研究員、趙林林、薛慶舉、楊尚等在采樣及水樣化學(xué)分析中給予的幫助.

圖5 Betaproteobateria 基于16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹(本研究所獲得的克隆子加粗顯示.克隆子前面的符號(hào)表示不同的文庫(kù):菹草處理(○)，苦草處理(△)，無草對(duì)照(□).克隆子后括號(hào)內(nèi)為其GenBank 登錄號(hào)，最后面為同一文庫(kù)中屬于同一OTU 的克隆子數(shù)目.從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的相似序列的生境置于其登錄號(hào)之前.中括號(hào)后為典型淡水浮游細(xì)菌類群，下同)Fig.5 Minimum evolution trees inferred by analysis of partial 16S rDNA sequences obtained from the tree studied clone libraries shown for Betaproteobacteria (The numbers of clones in each OTU (shown as bold)are given in parentheses.The symbols before each OTU donate its origin:Potamogeton crispus treatment (○)，Vallisneria natans treatment (△)and the control (□).The habitats of the most related sequences are given before their GenBank accession numbers.The reported typical freshwater bacterial clusters are shown after corresponding brackets，the same below)

圖6 除Betaproteobateria 外細(xì)菌門類基于16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Minimum evolution trees inferred by analysis of partial 16S rDNA sequences obtained from the tree studied clone libraries shown for the other phyla except Betaproteobacteria

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