肌酐酶法與堿性苦味酸法測定尿中肌酐含量的對比分析

王凱 彭珊茁 鄭曉梅 魏明至

肌酐被用于尿液中毒物含量檢測的校正。在一般情況下飲食、飲水量和利尿劑對肌酐的排出率沒有太大影響，每日的變化很小。用肌酐量來表示被測物濃度水平與接觸濃度有較好的相關(guān)性。目前，尿肌酐測定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為堿性苦味酸分光光度測定法［1］(WS/T 97-1996)。該方法為手工法，與全自動化的肌酐酶法相比較，操作繁瑣且效率較低。作者通過試驗(yàn)對比，肌酐酶法可以替代堿性苦味酸法用于尿肌酐含量的測定。

1 資料與方法

1.1 堿性苦味酸法

1.1.1 儀器 UV2100紫外-可見光分光光度計(jì)(北京萊伯泰科)。

1.1.2 試劑 約15 g/L飽和苦味酸溶液(臨用前過濾);100 g/L氫氧化鈉溶液;堿性飽和苦味酸溶液(氫氧化鈉溶液+飽和苦味酸上清液=1+10，臨用前配制);0.1 mol/L鹽酸(GR級);肌酐貯備液(經(jīng)110℃干燥2 h的肌酐100 mg，以鹽酸溶液稀釋至100 ml，配成濃度1.0 mg/ml肌酐貯備液);肌酐標(biāo)準(zhǔn)液(肌酐貯備液用水稀釋成0.1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液);肌酐標(biāo)準(zhǔn)曲線(分別取標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml，加水至3 ml，再向各管加入2 ml堿性苦味酸溶液，混勻，于室溫下反應(yīng) 20 ～30 min，加水 5 ml，混勻，配制成濃度為 0、1、2、3、4、5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液);試驗(yàn)用水全部為超純水。

1.1.3 原理 肌酐與過量苦味酸在堿性條件下反應(yīng)生成橙紅色苦味酸肌酐。在波長490nm處比色定量。

1.1.4 方法 取25 μl尿樣置于10 ml比色管中，加水至3 ml，空白直接加3 ml水。向各管加入2 ml堿性苦味酸溶液，混勻，于室溫下反應(yīng)20～30 min，加水5 ml，混勻。在波長490 nm下測吸光度，在0.5 h內(nèi)比色完畢。

1.2 肌酐酶法

1.2.1 儀器 TBA-120FR全自動生化分析儀(日本東芝)。

1.2.2 試劑 肌酐試劑盒(北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司，批號08-0222);0.85%生理鹽水(0.85 g氯化鈉溶于100 ml水中);試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2.3 原理 第一反應(yīng)，消除樣品中的內(nèi)源性肌酸及肌氨酸。第二反應(yīng)，樣品中的肌酐在肌酐酶的作用下生成肌酸。然后，在肌酸酶和肌氨酸氧化酶的作用下生成過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下生成醌類色素，以測定肌酐濃度。

1.2.4 方法 取20 μl尿樣，以0.85%生理鹽水稀釋至1 ml，混勻后，上機(jī)測定。

1.3 樣品 留取隨機(jī)新鮮尿樣，立即用兩方法同時測定，每批測定均在1 h內(nèi)完成。

2 結(jié)果

以兩種方法分別同時測定52例樣品，測定結(jié)果見表1。

表1 尿肌酐測定結(jié)果

兩種方法測定結(jié)果的正態(tài)性檢驗(yàn)見表2，均為正態(tài)分布。

表2 正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果

兩種方法的相關(guān)系數(shù)r=0.839，P＜0.0005，相關(guān)系數(shù)有高度顯著性，兩方法一致度良好。對兩種方法結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，t=-1.255，P=0.215，兩組數(shù)據(jù)無顯著性差異，二者不存在方法學(xué)誤差。

3 討論

3.1 線性范圍 肌酐酶法給定線性范圍為0-15 μg/ml，在本實(shí)驗(yàn)室條件下，可以做到15 μg/ml?？辔端岱?biāo)準(zhǔn)中給定線性范圍為 0 ～1000 μg/ml，給定的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為 0、200、400、600、800、1000 μg/ml。但按照其給出的標(biāo)準(zhǔn)系列配制步驟，從標(biāo)準(zhǔn)貯備液算起，實(shí)際配制的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度應(yīng)為0、2、4、6、8、10 μg/ml，相差了 100 倍，不知為何原因。在本實(shí)驗(yàn)室條件下，苦味酸法的線性范圍為0～6 μg/ml。所以，在本試驗(yàn)中，肌酐酶法的線性范圍明顯高于苦味酸法。

3.2 尿樣稀釋倍數(shù) 肌酐酶法要求尿樣稀釋50倍，在本試驗(yàn)中，在此稀釋倍數(shù)下，絕大多數(shù)樣品測定值均落入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)(0～15 μg/ml)，其余少數(shù)樣品至多稀釋100倍?？辔端岱?biāo)準(zhǔn)中尿樣稀釋100倍，但在本試驗(yàn)中，在此稀釋倍數(shù)下，絕大多數(shù)樣品測定值均在線性范圍之外(0～6 μg/ml)。約60%的尿樣稀釋400倍，結(jié)果可落在線性范圍內(nèi)。所以，在本試驗(yàn)中，苦味酸法的樣品稀釋倍數(shù)明顯高于肌酐酶法。稀釋倍數(shù)越大，測定結(jié)果的誤差也越大。

3.3 苦味酸法中超線性測定值再次稀釋的問題 超出線性范圍的樣品需再次稀釋測定。標(biāo)準(zhǔn)方法中未注明超線性的結(jié)果用什么稀釋，因其均以水定容，故本試驗(yàn)均以水做稀釋劑。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，再次稀釋樣品的測定值要低于直接稀釋至線性范圍內(nèi)的測定值。具體試驗(yàn)如下:選取10份尿樣，分別同時進(jìn)行兩種處理:A組直接稀釋400倍，按標(biāo)準(zhǔn)方法處理后測定，結(jié)果均處于線性范圍內(nèi);B組稀釋200倍，按標(biāo)準(zhǔn)方法處理后測定，結(jié)果均超出線性范圍，再以水將樣品稀釋2倍后測定，結(jié)果處于線性范圍內(nèi)。對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)(表3)，有顯著性差異，再次稀釋組(B)測定值低于直接測定組(A)。

表3 尿肌酐測定值

基于上述結(jié)果作者認(rèn)為，苦味酸法中再次稀釋對尿肌酐測定有影響。為嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，本試驗(yàn)的52份數(shù)據(jù)均為一次測定就落入線性范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，經(jīng)再次稀釋而得出的測定結(jié)果均沒有采用。

苦味酸法易受葡萄糖、維C、膽紅素等非肌酐色素原的干擾。肌酐酶法特異性好，是解決肌酐測定種非特異性干擾的根本途徑［2］。肌酐酶法操作簡單，快速，受限制條件較少，在大批量樣品檢測中效率明顯高于苦味酸法，是可以替代苦味酸法的尿肌酐測定方法。

［1］WS/T 97-1996.尿中肌酐分光光度測定方法.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.第3版.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程，2006:465-468.