不同抗菌藥物對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌L2β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)錄的影響

王麗麗，牛文凱，尹秀云，宋世平，尚學(xué)義，柏長(zhǎng)青，苑 鑫，李 艷

不同抗菌藥物對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌L2β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)錄的影響

王麗麗，牛文凱，尹秀云，宋世平，尚學(xué)義，柏長(zhǎng)青，苑 鑫，李 艷

目的：研究臨床常用抗菌藥物亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌產(chǎn)生L2β-內(nèi)酰胺酶的誘導(dǎo)作用，指導(dǎo)臨床抗菌藥物的使用。方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，研究0、1/4×MIC、1×MIC、4×MIC四種濃度的亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦的誘導(dǎo)作用，觀察前后L2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及變化。結(jié)果：1×MIC濃度的哌拉西林/他唑巴坦誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，亞胺培南無(wú)論任何濃度其誘導(dǎo)作用均較弱。結(jié)論：抗菌藥物亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦對(duì)L2β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生具有明顯誘導(dǎo)作用，其中酶抑制劑復(fù)合制劑作用最強(qiáng)，臨床上應(yīng)避免長(zhǎng)期應(yīng)用該類藥物，以免進(jìn)一步誘導(dǎo)嗜麥芽窄食單胞菌多藥耐藥性的產(chǎn)生。

嗜麥芽窄食單胞菌；β-內(nèi)酰胺酶；誘導(dǎo)性；多藥耐藥性

嗜麥芽窄食單胞菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，可產(chǎn)生兩種誘導(dǎo)性β-內(nèi)酰胺酶分別是L1、L2酶[1-2]，臨床抗菌藥物對(duì)其具有誘導(dǎo)作用，使β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)量增加，從而使其對(duì)多種抗生素耐藥，尤其對(duì)臨床常用的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物高度耐藥。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，從轉(zhuǎn)錄水平研究不同濃度的亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦為誘導(dǎo)劑時(shí)，誘導(dǎo)前后L2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及變化。從轉(zhuǎn)錄水平分析常用抗菌藥物對(duì)L2酶的誘導(dǎo)作用，指導(dǎo)臨床用藥。

1 資料和方法

1.1 菌株 臨床分離肺部感染患者痰中嗜麥芽窄食單胞菌1株，PCR擴(kuò)增L2基因陽(yáng)性。

1.2 主要試劑和儀器 亞胺培南（IP，杭州默沙東）、哌拉西林/他唑巴坦（PTC，Wyeth制藥）、E-test試條（AB BIODISK公司）；DNAse I、RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司）；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker、Premix Ex TaqTM（Takara公司）；IQ?5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3 PCR引物 根據(jù)嗜麥芽窄食單胞菌16S核糖體序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)內(nèi)參引物；根據(jù)GeneBank注冊(cè)的L2β-內(nèi)酰胺酶全基因序列設(shè)計(jì)引物（注冊(cè)號(hào)：Y08562），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。見表1。

1.4 不同濃度抗生素的誘導(dǎo)作用 臨床分離的嗜麥芽窄食單胞菌經(jīng)VITEK-32型全自動(dòng)細(xì)菌檢測(cè)儀進(jìn)行鑒定，用E-test試條進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）檢測(cè)，大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853為質(zhì)控菌。IP的MIC為32μg/ml、PTC的MIC為64μg/ml。根據(jù)兩種抗生素的MIC值，誘導(dǎo)濃度分為空白對(duì)照、1/4、1、4倍MIC的IP和PTC。將嗜麥芽窄食單胞菌接種于LB平皿上37℃孵育過(guò)夜，挑取1～2個(gè)菌落接種在5 ml LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床過(guò)夜培養(yǎng)，取50μl菌液至7份5 ml LB培養(yǎng)液中，振搖5 h至OD6000.6。在7份菌液中分別加入濃度為1/4、1、4倍MIC的IP、PTC和空白對(duì)照，37℃振搖孵育2 h。用Trizol法提取細(xì)菌RNA。

表1 PCR所用引物序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定L2轉(zhuǎn)錄水平 以細(xì)菌RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板，用IQ?5 Multicolor Real-Time PCR對(duì)誘導(dǎo)前后L2的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測(cè)定。內(nèi)參引物為16S-F、16S-R；L2引物為L(zhǎng)2-F、L2-R，熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μl，包括Premix Ex TaqT（M2×）12.5μl、引物（20μmol/L）0.5×2μl、cDNA模板1μl、ddH20 10.5μl。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，45個(gè)循環(huán)，在60℃單點(diǎn)收集熒光信號(hào)，延伸72℃ 7min。根據(jù)擴(kuò)增曲線確定Ct值，L2的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct表示。以16S rRNA為陽(yáng)性內(nèi)參對(duì)照基因，以校正cDNA模板的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的計(jì)算采用2-△△Ct方法，即△Ct目標(biāo)基因=Ct（目標(biāo)基因）-Ct（同一樣本16S rRNA）；△△Ct目標(biāo)基因=△Ct目標(biāo)基因（實(shí)驗(yàn)組）-△Ct目標(biāo)基因（對(duì)照組），相對(duì)倍數(shù)（實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組）=2-△△Ct。實(shí)驗(yàn)組為空白對(duì)照、1/4、1、4倍IP和PTC。PCR結(jié)束后取3μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果

圖1 兩種抗生素誘導(dǎo)前后細(xì)菌RNA電泳圖

2.1 不同抗生素誘導(dǎo)前后嗜麥芽窄食單胞菌RNA電泳圖 不同濃度的亞胺培南（IP）和哌拉西林/他唑巴坦（PTC）誘導(dǎo)2 h后，提取細(xì)菌RNA，發(fā)現(xiàn)均有電泳條帶。見圖1。 2.2L2轉(zhuǎn)錄前后變化 熒光定量PCR擴(kuò)增后，16S、L2轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物電泳圖。見圖2、3。以16S為內(nèi)參，計(jì)算誘導(dǎo)前后L2相對(duì)表達(dá)量，并做柱狀圖。見表2、圖4。PTC誘導(dǎo)的L2表達(dá)量比IP誘導(dǎo)的L2表達(dá)量明顯增多，以PTC在1倍MIC誘導(dǎo)濃度時(shí)，L2基因表達(dá)量最高。

表2 誘導(dǎo)前、后L2相對(duì)表達(dá)量

圖2 16S轉(zhuǎn)錄后電泳

圖3 L2轉(zhuǎn)錄后電泳

圖4 L2誘導(dǎo)前、后相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

嗜麥芽窄食單胞菌產(chǎn)生的L2酶為具有絲氨酸活性位點(diǎn)的頭孢菌素酶，屬于bush分類中的2e，其ORF表現(xiàn)G+C含量高達(dá)71.6%，該酶為二聚體，分子量57 kDa，等電點(diǎn)為8.2，可被克拉維酸抑制，主要水解頭孢菌素和單環(huán)類抗生素[2]。其組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)使該菌對(duì)多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。即在抗生素壓力下尤其是β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，能誘導(dǎo)L2酶的高水平表達(dá)[3]，從而使該菌對(duì)此類藥物產(chǎn)生高水平耐藥。而不同抗生素的誘導(dǎo)作用不完全一致。本研究應(yīng)用熒光定量PCR方法，研究不同濃度抗生素誘導(dǎo)后L2基因的轉(zhuǎn)錄水平差異，以確定常用抗生素對(duì)L2酶的誘導(dǎo)作用。

實(shí)驗(yàn)中選取一株產(chǎn)生L2β-內(nèi)酰胺酶的嗜麥芽窄食單胞菌，根據(jù)該菌對(duì)亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦兩種抗生素的MIC，分別研究0、1/4×MIC、1× MIC、4×MIC四種不同濃度抗生素的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)1×MIC濃度的哌拉西林/他唑巴坦誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，而亞胺培南，無(wú)論任何濃度其誘導(dǎo)作用均較弱。而既往的研究發(fā)現(xiàn)頭孢菌素、亞胺培南均具有誘導(dǎo)作用，但不同臨床菌株之間可能有差異。Avison等[4]通過(guò)16S rRNA的序列不同，將10株臨床菌株分為A、B、C 3組，用頭孢西丁誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，L2在A組中呈誘導(dǎo)后高水平表達(dá)，而在B、C組中表達(dá)水平極低，推測(cè)不同的嗜麥芽窄食單胞菌經(jīng)誘導(dǎo)后L2表達(dá)量不同，其機(jī)制不詳。Hu等[5]應(yīng)用頭孢菌素和青霉素類作為誘導(dǎo)劑測(cè)定L2β-內(nèi)酰胺酶的活性，以頭孢呋辛、頭孢曲松和頭孢噻肟為誘導(dǎo)劑時(shí)最高，而氨芐西林最低。另外的研究顯示，酶抑制劑克拉維酸對(duì)該酶同樣具有誘導(dǎo)作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度抗生素誘導(dǎo)前后L2相對(duì)表達(dá)量，以1倍MIC的哌拉西林/他唑巴坦最高，為211.16，其次是4倍濃度時(shí)，為72.22，而亞胺培南的誘導(dǎo)表達(dá)量為34.84，以4倍濃度時(shí)最高?？赡艿脑蚴牵琇2β-內(nèi)酰胺酶為頭孢菌素酶，不能水解碳青霉烯類抗生素，而誘導(dǎo)表達(dá)的L2酶很快被碳青霉烯類破壞有關(guān)。

β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床應(yīng)用最廣泛的一類抗菌藥物，但由于日益嚴(yán)重的耐藥性產(chǎn)生，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑是最好的解決途徑之一。哌拉西林與他唑巴坦聯(lián)合具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌具有較好的抗菌活性，臨床應(yīng)用廣泛[6]。但是，由于該制劑能夠誘導(dǎo)嗜麥芽窄食單胞菌L2酶表達(dá)量的增加，因此，臨床上在治療敏感菌引起的感染時(shí)，可能會(huì)誘導(dǎo)多藥耐藥嗜麥芽窄食單胞菌的產(chǎn)生并加劇其耐藥性，臨床醫(yī)師應(yīng)高度重視，避免該藥的長(zhǎng)期、廣泛應(yīng)用，若臨床上出現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌感染的流行，可考慮暫停該藥使用，或?qū)嵭休啌Q抗生素使用策略，以避免選擇或誘導(dǎo)耐藥菌的出現(xiàn)，尤其危重患者更應(yīng)高度警惕。碳青霉烯類的誘導(dǎo)作用不明顯，但臨床觀察中發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌引起的感染患者多數(shù)使用過(guò)碳青霉烯類藥物，可能的原因是碳青霉烯類為廣譜抗生素，使用該類藥物后將會(huì)殺滅敏感菌致使將對(duì)該類藥物天然耐藥的嗜麥芽窄食單胞菌選擇出來(lái)。

本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了常用抗菌藥物對(duì)β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生的具有誘導(dǎo)作用，對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，控制該菌引起的感染具有重要的實(shí)際價(jià)值。

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（收稿：2013-04-09 修回：2013-05-08 編校：齊 彤）

Effects of different antimicrobial agents on transcription of L2β-lactamase gene in stenotrophomonas maltophilia

WANG Li-li，NIU Wen-kai，YIN Xiu-yun，SONG Shi-ping，SHANG Xue-yi，BAI Chang-qing，YUAN Xin，LI Yan.Deptment of Respiratory Diseases，The People′s Liberation Army 307 Hospital，Beijing 100071，China

LI Yan，E-mail：liyanmdhuxi@163.com

Objective：To research the induction effects of clinical commonly used antibiotics，imipenem and piperacillin/tazobactam，on L2 β-lactamase of stenotrophomonas maltophilia，and instruct the usage of clinical antimicrobial agents.Methods：Real-Time fluorescent quantified PCR was used to study the induction effects of different concentration of imipenem and piperacillin/ tazobactam to L2 β-lactamase，and determine L2 gene mRNA transcriptional changes.Results：Stronger induction on L2 β-lactamase showed in 1×MIC concentration of piperacillin/tazobactam，and weaker in any concentrations of imipenem.Conclusion：The two antibiotics had obvious induction effects on the production of L2 β-lactamase，especially enzyme inhibitors.So this kind of antibacterial agents should be limited to avoid more severe multidrug resistance in stenotrophomonas maltophilia.

stenotrophomonas maltophilia；β-lactamase；induction；multidrug resistance

R 378

A

2095-3496（2013）02-0090-04

首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金資助（2009-3071）

100071 解放軍307醫(yī)院呼吸科（王麗麗，牛文凱，尚學(xué)義，柏長(zhǎng)青，苑 鑫，李 艷）；檢驗(yàn)科（尹秀云，宋世平）

李 艷，E-mail：liyanmdhuxi@163.com