李勝利 樊小軍 尹海榮 朱宏亮

·研究報告·

實驗豚鼠耳蝸外毛細胞靜纖毛束變異的發(fā)生率分析*

李勝利1，2樊小軍3尹海榮4朱宏亮2

目的通過觀察不同實驗豚鼠模型的耳蝸外毛細胞（OHC）靜纖毛束變異的發(fā)生率，探討OHC變異發(fā)生的可能原因。方法 57只豚鼠給予80 mg·kg-1·d-1慶大霉素連續(xù)注射30天（慶大霉素組）；33只豚鼠每天給予8小時96～100 d B SPL的工業(yè)噪聲連續(xù)暴露9天（噪聲暴露組）；耳蝸OHC靜纖毛束變異母體或父體豚鼠所產(chǎn)仔鼠22只，OHC靜纖毛正常父母體豚鼠產(chǎn)仔鼠32只，另以20只正常豚鼠作為對照組。所有實驗動物檢測ABR和DPOAE后，用光鏡和掃描電鏡觀察豚鼠耳蝸OHC靜纖毛束變異情況。結(jié)果 耳蝸各回均出現(xiàn)OHC靜纖毛束變異，外毛細胞第一排（OHC1）最明顯，而噪聲暴露組耳蝸第二、三回變異最嚴重，蝸頂和基底回逐漸變輕，該組動物耳蝸OHC靜纖毛束變異的發(fā)生率為30.30%；慶大霉素組耳蝸OHC靜纖毛束變異發(fā)生率為7.02%，以耳蝸基底回較嚴重，向蝸頂減輕，正常對照組動物耳蝸OHC靜纖毛束變異的發(fā)生率15.0%；而耳蝸OHC靜纖毛束變異的母體豚鼠所產(chǎn)的仔鼠均未發(fā)現(xiàn)OHC靜纖毛束變異的現(xiàn)象。結(jié)論 耳蝸OHC靜纖毛束變異并非遺傳所致，噪聲暴露可能是導(dǎo)致OHC靜纖毛束變異的重要因素之一。

耳蝸； 外毛細胞； 靜纖毛； 變異

已有英國、日本、美國和中國學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)實驗動物中有20%～80%的耳蝸外毛細胞（OHC）靜纖毛束變異，多表現(xiàn)為第一排外毛細胞靜纖毛束正向或反向轉(zhuǎn)位45°～90°，少數(shù)甚至達轉(zhuǎn)位180°，如：日本學(xué)者Fujita［1］在金黃地鼠（golden hamsters）、英國學(xué)者Comis［2］、Furness［3］和美國研究者Yoshida［4］及中國學(xué)者顧之平（1993）［5］、李勝利［6～8］等在豚鼠中多次發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象，Curtin等［9］在突變小鼠Celsr1觀察到同樣現(xiàn)象。耳蝸OHC變異的共同特點是：雙側(cè)耳蝸第一排外毛細胞（OHC1）靜纖毛束可見明顯45°～180°的“W”型轉(zhuǎn)向。耳蝸外毛細胞靜纖毛束變異對聽功能有一定影響，這些變異的實驗動物雖然聽性腦干反應(yīng)無明顯改變，但聽神經(jīng)動作電位（compound action potentials，CAP）和耳蝸微音器電位（cochlear microphonic，CM）明顯下降［1］，CAP閾值較正常動物升高5～10 dB［4］。鑒于耳蝸OHC靜纖毛束變異在各種實驗動物出現(xiàn)的普遍性，尤其在豚鼠較多見［3～8，10］，有必要了解耳蝸OHC 靜纖毛束變異的原因是遺傳因素還是環(huán)境因素等，因此，本研究對光鏡和掃描電鏡觀察到耳蝸OHC靜纖毛束變異懷孕豚鼠所產(chǎn)仔鼠及慶大霉素耳中毒及噪聲致聾實驗豚鼠耳蝸OHC靜纖毛束變異進行對比分析，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 青年雜色與白色豚鼠，體重350～450 g，耳廓反射正常，雌雄各半，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，各研究動物實驗情況及外毛細胞靜纖毛束變異動物數(shù)見表1。57只豚鼠給予80 mg·kg-1·d-1慶大霉素（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，國藥準字H37021973）連續(xù)注射30天（慶大霉素組）；33只豚鼠每天給予8小時96～ 100 dB SPL的工業(yè)噪聲（由陜西煤礦機械廠風(fēng)機車間的壓縮風(fēng)機產(chǎn)生）連續(xù)暴露9天（噪聲暴露組）；取各動物左側(cè)耳蝸2.5%戊二醛固定，掃描電鏡觀察；右側(cè)耳蝸行光鏡觀察。

由4只母體和2只父體耳蝸OHC靜纖毛束變異豚鼠所生產(chǎn)的仔鼠22只為仔鼠組，觀察其耳蝸OHC靜纖毛束變異的遺傳情況；另選正常父母體豚鼠11窩共生產(chǎn)的32只仔鼠作為對照組；該2組均在3月齡后處死，左側(cè)耳蝸行掃描電鏡觀察；右側(cè)耳蝸行光鏡觀察。仔鼠均單籠喂養(yǎng)。仔鼠組和對照組動物譜系圖見圖1、2。

1.2 實驗方法 慶大霉素組在用藥30天后、噪聲暴露組在噪聲暴露9天后、仔鼠組和對照組在3月齡后即刻行ABR及DPOAE檢測，然后各組分別完成耳蝸鋪片及掃描電鏡觀察耳蝸。

圖1 耳蝸外毛細胞靜纖毛束變異的父體或母體豚鼠產(chǎn)仔鼠（仔鼠組）譜系圖

圖2 正常豚鼠產(chǎn)仔鼠（對照組）譜系圖

1.2.1 ABR和DPOAE檢測 用美國智聽公司Smart EP誘發(fā)電位儀檢測ABR波Ⅲ反應(yīng)閾及各波潛伏期，短聲刺激率19.30次／秒，由DH49耳機發(fā)出。前置放大增益100.0 k，帶通濾波100～3 000.0 Hz，疊加560次，DPOAE記錄：f2／f1＝1.22，L1＝L2＝65 dB SPL，疊加36次，增益100.0 k，由ER-10B+探頭給聲和記錄。

1.2.2 耳蝸鋪片毛細胞觀察計數(shù) 動物麻醉后斷頭，取下雙側(cè)聽泡，暴露出耳蝸，一側(cè)耳蝸在手術(shù)顯微鏡下挑破圓窗和卵圓窗膜，在蝸尖挑一小孔，緩慢灌入0.5%Ag NO3染色液10～20 ml，蒸餾水洗后，注入10%福爾馬林，日光下曝光2～4小時后，在手術(shù)顯微鏡下進行耳蝸鋪片，40倍鏡下以三排外毛細胞占滿一個視野進行計數(shù)。在奧林巴斯顯微鏡下，沿基底膜由蝸頂向蝸底連續(xù)按顯微鏡視野來計數(shù)外毛細胞，整個基底膜可計數(shù)到20～25個顯微鏡視野，每個視野的直徑長度為1 mm，取20個視野繪制耳蝸毛細胞分布圖。

毛細胞靜纖毛束“W”或“V”字形轉(zhuǎn)向大于45°、轉(zhuǎn)向90°和轉(zhuǎn)向180°即認定為變異，逐個視野連續(xù)分回計數(shù)出OHC變異的百分率，繪制出耳蝸基底膜各部位的毛細胞變異分布圖。

1.2.3 掃描電鏡觀察 用細鋼針挑破耳蝸蝸頂和耳蝸底回圓窗及卵圓窗后，快速灌入2.5 mmol／L戌二醛PBS液，置4℃固定4 h，入1.0 mmol／L鋨酸固定2 h，PBS洗滌后在手術(shù)顯微鏡下去除耳蝸骨殼、蓋膜及部分血管紋組織，充分暴露出Corti器上的基底膜內(nèi)外毛細胞。梯度乙醇脫水，臨界點干燥，噴金，定位后在SEM上觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Microsoft Office Excel錄入數(shù)據(jù)，計算平均值。所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0 for Window軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 各組豚鼠OHC靜纖毛束變異率 各組豚鼠中共19只有耳蝸OHC靜纖毛束變異（表1）。

表1 各組實驗動物OHC靜纖毛束變異率

耳蝸各回均出現(xiàn)OHC靜纖毛束變異，外毛細胞第一排（OHC1）最明顯；噪聲暴露組耳蝸第二、三回變異最嚴重，蝸頂和基底回逐漸變輕（圖1），慶大霉素組耳蝸OHC靜纖毛束變異在耳蝸基底回較嚴重，向蝸頂逐漸減輕（表2）。

2.1.2 OHC1轉(zhuǎn)向角度分布率 OHC靜纖毛束“W”型變異表現(xiàn)在：①變形：呈不規(guī)整形，多彎曲狀變形，“W”角變鈍或變狹小，兩臂長短不一，間距加寬或變成直弧形；少數(shù)呈Ω形。②轉(zhuǎn)位：OHC靜纖毛束多數(shù)轉(zhuǎn)位90°角，朝向蝸底轉(zhuǎn)位較多，少數(shù)朝向蝸尖，?？梢娺B續(xù)數(shù)個毛細胞90°轉(zhuǎn)向蝸底，亦常見+90°和-90°相向出現(xiàn)，并相互伴隨出現(xiàn)，部分OHC靜纖毛束“W”形轉(zhuǎn)位達180°角（圖3、4）。

噪聲暴露組豚鼠耳蝸OHC靜纖毛束變異較變形嚴重，而且轉(zhuǎn)向90°和180°的較多（圖3）；而慶大霉素組耳蝸OHC靜纖毛束變異轉(zhuǎn)向90°常見，轉(zhuǎn)向180°的較少（表2，圖4）。仔鼠組22只未發(fā)現(xiàn)耳蝸OHC靜纖毛束變異現(xiàn)象（圖1）。

2.2 ABR及DPOAE檢測結(jié)果 OHC靜纖毛束變異耳（28耳）ABR反應(yīng)閾有一定上升（40～50 dB SPL），平均值為38.93±3.56 d B SPL（表3），且ABR波形較散亂、重復(fù)性差、波幅衰減較快，但ABR波Ⅰ、Ⅲ潛伏期與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。OHC靜纖毛束變異豚鼠DPOAE幅值與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

OHC靜纖毛束變異組在噪聲暴露前的DPOAE幅值與噪聲暴露9天后有明顯的差異，差異主要出現(xiàn)在中頻區(qū)，而高頻區(qū)沒有顯著差異。噪聲暴露前后正常組與變異組DPOAE幅值比較，在4 018 Hz以上頻率，沒有明顯變化，而在504～2 844 Hz，變異組噪聲暴露前DPOAE的幅值較正常組略降低，噪聲暴露后DPOAE幅值降低更明顯，與正常組噪聲暴露后比較，DPOAE幅值下降更顯著（圖5）。

圖3 噪聲暴露組耳蝸外毛細胞靜纖毛束變異的掃描電鏡觀察 a正常OHC靜纖毛束“V”字型0°方向與OHC靜纖毛束“V”字形轉(zhuǎn)向180°角；b為噪聲損害后OHC缺失及靜纖毛束轉(zhuǎn)向90°和180°角；c、d為噪聲暴露后OHC及靜纖毛束轉(zhuǎn)向45°、90°

圖4 慶大霉素中毒組耳蝸外毛細胞靜纖毛變異的掃描電鏡觀察 a為慶大霉素注射30天后，耳蝸OHC靜纖毛束“V”字形轉(zhuǎn)向45°和90°角；b為慶大霉素損害后OHC缺失及靜纖毛束轉(zhuǎn)向45°和90°角；c、d為慶大霉素注射后OHC消失及靜纖毛束轉(zhuǎn)向45°、90°

表2 噪聲暴露組和慶大霉素組豚鼠耳蝸各回第一排外毛細胞靜纖毛束變異細胞計數(shù)平均值

表2 噪聲暴露組和慶大霉素組豚鼠耳蝸各回第一排外毛細胞靜纖毛束變異細胞計數(shù)平均值

組別第一回總數(shù) 轉(zhuǎn)向90° 轉(zhuǎn)向180°第二回總數(shù) 轉(zhuǎn)向90° 轉(zhuǎn)向180°第三回總數(shù) 轉(zhuǎn)向90° 轉(zhuǎn)向180°180°噪聲暴露組18.7± 2.06第四回總數(shù) 轉(zhuǎn)向90° 轉(zhuǎn)向0.82慶大霉素組12.1± 7.3 14.5± 1.87 4± 0.98 26.0± 4.47 20.4± 1.83 4.9± 2.1 22.8± 3.91 19.6± 3.23 3.6± 1.31 11.0± 0.82 8.5± 2.06 2.0± 0.2± 0.33 8.9± 3.75 3.8± 2.95 16.7± 6.03 13.5± 3.96 3.5± 2.54 15± 1.98 13.7± 1.02 0.6± 0.24 3.4± 0.92 3.2± 0.97

表3 耳蝸外毛細胞靜纖毛束正常組與變異組豚鼠ABR反應(yīng)閾及各波潛伏期和波間期比較

表3 耳蝸外毛細胞靜纖毛束正常組與變異組豚鼠ABR反應(yīng)閾及各波潛伏期和波間期比較

組別動物數(shù)（只）耳數(shù)ABR反應(yīng)閾（dB SPL）波潛伏期（ms）Ⅰ ⅢⅠ-Ⅲ波間期（ms）變異組14 28 38.93±6.18 1.29±0.13 2.89±0.23 1.60±0.13正常組14 28 34.29±6.23 1.26±0.08 2.84±0.11 1.58±0.07

表4 耳蝸外毛細胞靜纖毛束變異組及正常組豚鼠DPOAE幅值

表4 耳蝸外毛細胞靜纖毛束變異組及正常組豚鼠DPOAE幅值

頻率（Hz）504 712 1 005 1 470 2 011 2 844 4 018 5 665 8 040正常組14 28 19.07±6.82 18.77±3.72 18.39±4.76 22.92±6.27 18.23±9.77 8.23±8.98 3.32±6.93 23.31±組別動物數(shù)（只）耳數(shù)（耳）6.43 30.15±4.83變異組14 28 14.06±4.79 14.67±6.57 19.61±6.23 21±4.46 20.33±5.05 10.06±8.22 1.72±4.98 22.11±6.68 29.89±5.52

圖5 外毛細胞靜纖毛束變異組及正常組噪聲暴露前后DPOAE幅值比較

3 討論

3.1 耳蝸外毛細胞靜纖毛束變異的判定標準Furness等［3］觀察注射卡那霉素及正常對照組豚鼠耳蝸毛細胞時發(fā)現(xiàn)外毛細胞靜纖毛束轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象，并觀察到外毛細胞靜纖毛束的“W”形變形約占10%和20%，在其實驗豚鼠的出現(xiàn)率為27%，但靜纖毛束的頂部連接和與蓋膜的接觸正常。Fujita［1］綜合Comis和Furness等的研究結(jié)果［2，3］，提出毛細胞靜纖毛束轉(zhuǎn)位和變形的5個特征：①耳蝸第一排OHC普遍出現(xiàn)異常；②OHC靜纖毛束的“W”形變形，但靜纖毛束的頂部連接和與蓋膜的接觸正常；③變異的OHC表皮板在正常位置和范圍；④雙側(cè)耳蝸同時出現(xiàn)異常；⑤耳蝸第一排OHC變異對耳蝸聽功能有顯著影響。顧之平等［5］發(fā)現(xiàn)6只豚鼠中3只有明顯耳蝸外毛細胞靜纖毛束轉(zhuǎn)變異，均呈雙側(cè)性，其變異特點是：①變異呈不規(guī)整型，多彎曲狀，靜纖毛束“W”形的角度變鈍、變銳，兩臂長短不一或間距加寬等；②轉(zhuǎn)位：正常OHC其“W”形開口的縱軸以蝸軸為中心，放射線之間成很小角度，略向蝸尖傾斜，轉(zhuǎn)位毛細胞由輕度轉(zhuǎn)位至90°改變，左右方向亦不一定。Yoshida等［4］在100只豚鼠中發(fā)現(xiàn)24%的動物耳蝸靜纖毛束異常和轉(zhuǎn)位，CAP閾值提高5～ 10 dB，他認為毛細胞轉(zhuǎn)位45°為變異標準。McFadden等［11］的研究中栗鼠正常耳蝸毛細胞第一排外毛細胞約有50%的靜纖毛束轉(zhuǎn)位，但他們認為是正常的耳蝸形態(tài)［7］。Curtin等在突變Celsrl1小鼠中發(fā)現(xiàn)胚胎和成年動物耳蝸頂回3.6%、底回1.68%的OHC靜纖毛束轉(zhuǎn)向，認為是該動物突變的表型［9］。李勝利等［7］發(fā)現(xiàn)8只豚鼠中耳蝸外毛細胞多數(shù)轉(zhuǎn)位90°角，朝向蝸底方向轉(zhuǎn)位較多，少數(shù)朝向蝸頂方向轉(zhuǎn)位，個別轉(zhuǎn)位達180°?？梢?，上述各研究者對OHC靜纖毛束轉(zhuǎn)向角度的認定差異較大，由20°～180°不等，但以45°和90°較多；OHC靜纖毛束變異的百分率各家差異也較大，由10%～70%不等；但所有研究者基本認定OHC1靜纖毛束變異或轉(zhuǎn)向最多。綜上所述，結(jié)合本實驗結(jié)果，認為耳蝸OHC靜纖毛束變異的判斷標準為：①超過10%的第一排外毛細胞靜纖毛束的“W”形變形及轉(zhuǎn)位毛細胞由45°轉(zhuǎn)位至90°角改變，多向基底方向，且呈雙側(cè)性。②OHC靜纖毛束轉(zhuǎn)位變異程度：Ⅰ型：50%的OHC靜纖毛束變異為重度變異；Ⅱ型：30%的OHC靜纖毛束變異為中度變異；Ⅲ型：10%以上的OHC靜纖毛束變異為輕度變異。③耳蝸毛細胞靜纖毛束變異動物的雙耳聽功能改變。

3.2 耳蝸外毛細胞靜纖毛束變異的原因 從文中結(jié)果看，噪聲暴露組豚鼠耳蝸OHC靜纖毛束變異的出現(xiàn)率較高，達到30.30%；而慶大霉素組僅為7. 02%，低于正常對照組的15.0%。耳蝸OHC靜纖毛束變異的細胞計數(shù)亦可見噪聲暴露組豚鼠耳蝸OHC靜纖毛束變異的數(shù)較多，而且變異細胞轉(zhuǎn)向180°的較多，變異程度較慶大霉素組重。但母體變異者所生下的仔鼠未發(fā)現(xiàn)耳蝸OHC靜纖毛束變異的現(xiàn)象，說明噪聲導(dǎo)致耳蝸OHC靜纖毛束變異的發(fā)生可能與遺傳無關(guān)，與Wenngrn等［12］、顧之平［5］和孫建和等［10］關(guān)于耳蝸OHC靜纖毛束變異是由于遺傳變異引起的觀點不一致。

本實驗中正常豚鼠耳蝸的OHC靜纖毛束變異發(fā)生率為6.25%，而在2002年的研究［6］中耳蝸OHC靜纖毛束變異的發(fā)生率是40%，慶大霉素耳中毒組僅為7.02%，2005年［7］的實驗中慶大霉素注射后耳蝸OHC靜纖毛束變異發(fā)生率為16.7%，差異較大，可能與實驗動物種群不同有關(guān)。

Yoshida和Liberman（1999）發(fā)現(xiàn)在三次噪聲暴露的實驗豚鼠中，耳蝸OHC靜纖毛束變異的發(fā)生率在14%到33%之間，顧之平和Goodwin（1993）發(fā)現(xiàn)單耳較短時間（45分鐘）中等強度白噪聲（75 dB A）刺激過程中6只白色豚鼠中3只有明顯的外毛細胞靜纖毛束變異。孫建和等［9］噪聲暴露實驗中187只豚鼠均無耳蝸OHC靜纖毛束的轉(zhuǎn)位。這可能與噪聲暴露的類型及強度和時間差異有關(guān)。

Dabdoub等［13］的研究證明Wnt信號蛋白對毛細胞靜纖毛束定向發(fā)育起作用，而Wnt信號蛋白的破壞導(dǎo)致耳蝸毛細胞靜纖毛束定向的缺乏，可使三排外毛細胞和內(nèi)毛細胞靜纖毛束變異，他認為這種現(xiàn)象與Fujita［1］、Comis［2］、Furness［3］和Yoshida［4］等觀察到的耳蝸第一排外毛細胞靜纖毛束變異是一致的，可導(dǎo)致聽敏度明顯下降。耳蝸毛細胞纖毛的結(jié)構(gòu)、運轉(zhuǎn)機制、發(fā)育過程與非經(jīng)典Wnt／平面細胞極性（PCP）通路之間有密切聯(lián)系，肌動蛋白解聚作用與PCP相關(guān)蛋白對毛細胞纖毛發(fā)育和功能有影響，但這種影響在耳蝸毛細胞靜纖毛束定向發(fā)生變異的三排外毛細胞均出現(xiàn)，Curtin等［9］在突變小鼠Celsr1觀察到同樣的現(xiàn)象。而本實驗和Furness［3］、Yoshida［4］、顧之平［5］和孫建和等［10］發(fā)現(xiàn)豚鼠耳蝸外毛細胞變異均發(fā)生在第一排，認為這種變異完全不同于Wnt信號和基因突變導(dǎo)致耳蝸三排OHC靜纖毛束定向發(fā)育異常的表型，耳蝸第一排OHC靜纖毛束變異是環(huán)境因素造成的可能性較大。

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（2012-09-03收稿）

（本文編輯 李翠娥）

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.023

時間：2013-3-11 10：03

R764.35

A

1006-7299（2013）04-0403-04

* 國家自然科學(xué)基金面上項目（39970785，81170922）、主任基金項目（30440080）聯(lián)合資助

1 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院科研實驗中心（西安710004）； 2 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究中心； 3 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室； 4 寧夏銀川市第一人民醫(yī)院

李勝利（Email：lishengli59＠163.com）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130311.1003.009.html