黃金波

（江蘇省新沂市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 221400）

犬的部分器官切片的制備

黃金波

（江蘇省新沂市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 221400）

犬做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，目前已被廣泛應(yīng)用于藥物試驗(yàn)、毒理學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)，功能與疾病、動(dòng)物模型等領(lǐng)域的研究。因此研究正常犬的肝臟與腎臟的組織結(jié)構(gòu)能夠?yàn)榕R床診治患病犬、為臨床給藥的藥效學(xué)研究提供基本組織學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與固定 新沂地區(qū)健康成年雜種犬1只，以20g/L戊巴比妥鈉麻醉加頸動(dòng)脈放血處死。采取肝、腎組織樣品，經(jīng)10 %中性福爾馬林溶液固定。

1.2 儀器與試劑 光學(xué)顯微鏡(O1ympus)，顯微成像系統(tǒng)(O1ympus)和組織切片機(jī)(LEICA RM2015)。試劑有福爾馬林、無(wú)水乙醇、二甲苯、蘇木精和伊紅等。

1.3 組織切片的制備 （1）脫水與透明：將固定好的犬的肝臟與腎臟投入酒精脫水，經(jīng)過(guò)70%、85%、95%I、95%II酒精各1h，100%I、100%II酒精各45min脫水，保證組織中水分脫除干凈。然后入二甲苯I、二甲苯II各7min。（2）透蠟：在透蠟以前，先將蠟放入溫箱內(nèi)融化，溫箱溫度保持約55～60℃，將己經(jīng)透明的組織放入二甲苯和石蠟混合液內(nèi)30min，然后入純蠟1，2杯各透蠟1h。（3）包埋：將溶好的石蠟注入包埋筐內(nèi)，用鑷子夾取組織放入筐的適當(dāng)位置，將要切的面朝向筐的底部。輕輕移入冷水中，待石蠟全部變硬即取出，在石蠟表面貼上有標(biāo)本號(hào)碼的標(biāo)簽紙。（4）修切蠟塊：剝出蠟塊，將蠟塊修切成正方形，將組織塊以外的多余石蠟修去，在組織四周留有少許石蠟，蠟塊兩邊必須切成平行的直線，避免切下的蠟條彎曲。（5）切片：用切片機(jī)LEICA RM2015進(jìn)行切片，刀的傾斜角為30度左右；將蠟塊固定在切片機(jī)上，調(diào)整刻度指針到5μm，用右手握轉(zhuǎn)輪把柄，搖轉(zhuǎn)切片機(jī)，左手持一毛筆托住蠟帶，隨著切片機(jī)的轉(zhuǎn)動(dòng)，輕輕把蠟帶拉開(kāi)，用毛筆托住蠟帶，挑斷后順序放在紙上。（6）貼片、烤片：用一大燒杯盛溫水，放入42℃恒溫水浴鍋內(nèi)，將蠟片攤于水面上，蠟片受熱自然張開(kāi)浮游在水面上。將載玻片伸入水中把蠟片移至玻片上，撥正位置，傾去多余水滴后放入37℃溫箱中烤干，經(jīng)過(guò)10h后取出。（7）染色：將組織切片經(jīng)過(guò)二甲苯I、二甲苯II各10min進(jìn)行脫蠟，經(jīng)過(guò)100%I、100%II酒精各1min，95%I、95%II酒精各2min，85%酒精1min，入蒸餾水1min。蘇木素液染色液7min，流水沖洗1min，1%鹽酸-乙醇1～3s，流水沖洗1～2min，蒸餾水洗1min，0.5%伊紅液染色2min，蒸餾水稍洗1～2s，80%酒精1～2s，95%酒精I(xiàn)、95%酒精I(xiàn)I各2min，100%I、100%II酒精各5min，二甲苯I5min，二甲苯II10min，中性樹(shù)膠封片。（8）拍照：中性樹(shù)膠封片后，組織切片用O1ympus顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 肝臟的組織結(jié)構(gòu)

圖1 肝組織結(jié)構(gòu)×40

圖2 肝組織結(jié)構(gòu)×400

肝臟表面被膜極薄，被膜下毛細(xì)血管非常豐富。肝小葉間無(wú)結(jié)締組織，小葉間分界不清。肝細(xì)胞呈多邊形，核圓形，肝細(xì)胞排列較緊密，呈不規(guī)則條索狀形成肝細(xì)胞索，向四周延伸，在肝細(xì)胞索(肝板)之間是血竇，肝細(xì)胞索呈彎曲、分支和吻合狀態(tài)(圖1)。肝內(nèi)結(jié)締組織極少，主要分布在門(mén)管區(qū)周圍，門(mén)管區(qū)內(nèi)含門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈和膽管分支(圖2)。

2.2 腎臟的組織結(jié)構(gòu)

圖3 腎組織結(jié)構(gòu)×100

圖4 腎組織結(jié)構(gòu)×400

腎單位是組成腎臟的結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，腎單位包括腎小囊、腎小球和腎小管。腎小球是由毛細(xì)血管網(wǎng)組成的，腎小球外有腎小囊的包囊，囊腔與腎小管相通(圖3，圖4)。

3 討論

3.1 組織的固定 在組織固定的過(guò)程中，應(yīng)將標(biāo)本于離體后，盡快浸泡于裝有足夠量固定液的容器中固定。固定液量應(yīng)為被固定標(biāo)本體積的5～10倍。切取的標(biāo)本置放于容器中固定后，應(yīng)盡快修整繼續(xù)固定。對(duì)未能及時(shí)、充分固定的標(biāo)本用于制做切片。

3.2 組織的透明與浸蠟 組織塊在二甲苯中透明的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，組織呈現(xiàn)透明即可，以防組織硬、脆，尤其是肝臟的組織塊在透明的過(guò)程中更應(yīng)注意到這點(diǎn)。若組織經(jīng)二甲苯透明不充分，則在之后的浸蠟過(guò)程中，蠟不容易侵入組織塊內(nèi)。浸蠟時(shí)間適宜，過(guò)短時(shí)浸蠟不充分，組織會(huì)過(guò)軟，過(guò)長(zhǎng)時(shí)組織硬脆。

3.3 切片的染色 在組織切片染色過(guò)程中，要不斷改變時(shí)間，摸索出蘇木精與伊紅的停留時(shí)間，用顯微鏡控制細(xì)胞核的蘇木素染色質(zhì)量，使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)顏色鮮明，對(duì)比清晰。

S852.16+2

B

1007-1733(2013)02-0071-01

2012–12–07）