劉瀠蔚，田見(jiàn)暉，龐云渭，郭 敏，楊美玲，張 倩，王曉紅，安 磊*，張林波

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物制藥創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

豬精子不同處理方式對(duì)其IVF的影響

劉瀠蔚1，2，田見(jiàn)暉2，龐云渭2，郭 敏2，楊美玲2，張 倩2，王曉紅2，安 磊2*，張林波1*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物制藥創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

豬體外受精(in vitro fertilization，IVF)技術(shù)效率的不穩(wěn)定性限制了該技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用。本研究比較了精子獲能前后的狀態(tài)和活精子數(shù)之間的關(guān)系;精子獲能后的濃度和狀態(tài)對(duì)IVF后胚胎卵裂率、囊胚率的影響;不同個(gè)體來(lái)源的精子混合后對(duì)IVF卵裂率、囊胚率的影響。結(jié)果表明:精子獲能前后，活精子數(shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05);檢測(cè)精子的濃度與狀態(tài)與卵裂率、囊胚率無(wú)直接關(guān)聯(lián);利用混合精子進(jìn)行IVF，單一精子所得到的IVF囊胚率分別是A 17.00%、B 12.24%、C 33.00%、D 4.81%、E 10.00%、F 22.00%，混合精子的囊胚率分別是A+B 77.00%、C+D 67.01%、E+F 35.50%，混合精子和單一精子的囊胚率差異不顯著。

豬;體外受精;精子;獲能

安磊，男，講師。E－mail:anleim@yahoo.com.cn

長(zhǎng)期以來(lái)，豬的體外受精(IVF)一直存在技術(shù)效率低、穩(wěn)定性差的問(wèn)題，具體表現(xiàn)為多精入卵率高、雄原核形成率低、IVF后胚胎發(fā)育率低等［1］。相關(guān)研究報(bào)道表明，精子的質(zhì)量和處理方式等因素對(duì)豬的IVF效率存在顯著影響。Piotr Miciński的研究結(jié)果表明，精子形態(tài)和活力并不能有效地反映其受精能力［2］。而精子在獲能前的濃度與狀態(tài)能否反映精子獲能后的相關(guān)指標(biāo)，以及精子的受精能力還有待確定。

諸多研究表明，不同個(gè)體、不同批次的精子，各項(xiàng)指標(biāo)及受精能力差異很大［3～8］，這也是導(dǎo)致IVF體系不穩(wěn)定的重要因素之一。因此，通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的精子進(jìn)行混合，可能會(huì)減少或彌補(bǔ)個(gè)體及批次間差異對(duì)IVF效率造成的不利影響。同時(shí)，觀察混合后精子活力、數(shù)目等指標(biāo)能否得到改善，以及囊胚率是否有所提高。

本實(shí)驗(yàn)比較了精子在獲能前后的狀態(tài)和密度，研究了獲能后精子的狀態(tài)對(duì)IVF卵裂率和囊胚率的影響。同時(shí)，研究了不同個(gè)體來(lái)源的精子混合對(duì)IVF胚胎發(fā)育效率的影響，為豬IVF效率的改進(jìn)提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 卵巢和卵母細(xì)胞的采集

豬的卵巢取自北京周邊屠宰場(chǎng)。將離體卵巢立即放入裝有預(yù)熱的加有雙抗的38.5℃生理鹽水的保溫瓶中，2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 豬的精液

豬的精液來(lái)源于北京中順景盛種豬改良有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)用主要試劑

TCM－199購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;其余藥品均購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司。

基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液為TCM－199。新購(gòu)的M199(500 mL)需加青霉素G 0.0325 g，鏈霉素0.025 g，溶好后過(guò)濾。添加的10%卵泡液，添加終濃度為0.1 mg/mL的L－半胱氨酸和終濃度為10 ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子。

操作液TL:65.0 mol青霉素、50 mg/mL鏈霉素、114.00 mol NaCl、3.20 mol KCl、2.00 mol NaHCO3、2.00 mol CaCl2·2H2O、0.34 mol KH2PO4、0.50 mol MgCl2·6H2O、10.00 mol HEPES、10.00 mol乳酸鈉、0.20 mol丙酮酸鈉、12.00 mol D－山梨醇、0.3%BSA，pH=7.2。

受精液為改良Tris緩沖液(mTBM)，成分為:113.1 mol NaCl、3.0 mol KCl、7.5 mol CaCl2·2H2O、20.0 mol Tris、11.0 mol葡萄糖、5.0 mol丙酮酸鈉、2 mol咖啡因、0.2%BSA，pH=7.6～7.8。

胚胎培養(yǎng)液PZM－3:108.00 mol NaCl、10.00 mol KCl、0.35 mol KH2PO4、0.40 mol MgSO4·7H2O、25.07 mol NaHCO3、0.20 mol丙酮酸鈉、2.00 mol Ca－(lactate)2·5H2O、1.00 mol L－谷氨酰胺、5.00 mol?；撬?、20.00 mol BME、10.00 mol MEM、0.065 mol青霉素G、0.050 mol鏈霉素、4.00 mol BSA，pH=7.2～7.4。以上所有試劑都用0.22μm濾器過(guò)濾。

1.4 豬卵母細(xì)胞體外成熟

豬卵巢用含有雙抗的生理鹽水清洗兩次后轉(zhuǎn)入38.5℃的水浴鍋中。用20 mL注射器選擇2～6 mm的卵泡抽取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，用TL清洗兩次，在鏡下挑取包裹有3層以上的COCs。

將挑選的COCs在覆蓋有石蠟油預(yù)先平衡好的TCM－199微滴中洗3次，轉(zhuǎn)入覆蓋有石蠟油預(yù)先平衡好的TCM－199培養(yǎng)微滴中(100μL)，每滴100個(gè)卵母細(xì)胞，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)條件是5%CO2的空氣，38.5℃及100%相對(duì)飽和濕度。

1.5 豬精液的處理

取出3 mL精液，在處理前先取出100μL，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并在顯微鏡下觀察精子的活力 (活率)，游動(dòng)狀態(tài)，是否斷尾及死精的多少，并記錄統(tǒng)計(jì)。吸取2 mL精液先用TL清洗并離心兩次，再用mTBM清洗離心一次，然后在5%CO2的空氣，38.5℃及100%相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中獲能40 min。取上浮的精子300μL在顯微鏡下計(jì)數(shù)，觀察狀態(tài)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 卵母細(xì)胞的體外受精

將成熟好的COCs脫除顆粒細(xì)胞，挑取排出第1極體的卵母細(xì)胞。用mTBM做受精液，每滴50μL，每滴放入15～20個(gè)，然后向每個(gè)受精滴放入50μL受精獲能后的精液，單一精液組共分為6組，分別命名為A、B、C、D、E、F，混合組分別分為A+B、C+D、E+F。放入5%CO2，38.5℃及100%相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精6 h，受精結(jié)束后轉(zhuǎn)入覆蓋有石蠟油預(yù)先平衡好的PZM－3微滴(70μL)中洗掉精子，再換入覆蓋有石蠟油的預(yù)先平衡好的PZM－3培養(yǎng)微滴中進(jìn)行培養(yǎng)，每滴70μL，30個(gè)卵母細(xì)胞。培養(yǎng)2 d后觀察卵裂率，7 d觀察囊胚率。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(Mean±SD)，利用SPSS中One Way－ANOVA過(guò)程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲能前后精子數(shù)目、狀態(tài)的比較

精子在獲能前后均用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并在顯微鏡下觀察精子的活力 (活率)、游動(dòng)狀態(tài)的情況，以及是否斷尾及死精的比例(圖1)。

圖1 不同種公豬獲能前后精子數(shù)的比較

結(jié)果表明，精子在獲能前后其活精子數(shù)、死精子數(shù)無(wú)必然聯(lián)系，數(shù)據(jù)差異不顯著(P＞0.05)。同時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)精子的狀態(tài)在獲能前后也不存在關(guān)聯(lián)性。同一精子在獲能前畸形多，精子存在凝集現(xiàn)象，但是獲能后直線運(yùn)動(dòng)的精子所占比例很高，且畸形精子率很低;反之，獲能前精子活力很好，直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)很多，但在獲能后卻有相當(dāng)一部分“轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)”，甚至出現(xiàn)畸形精子。

2.2 精子的數(shù)目、狀態(tài)對(duì)卵裂率和囊胚率影響

用不同個(gè)體的精子進(jìn)行體外受精，記錄卵裂率與囊胚率。與相對(duì)應(yīng)的精子狀態(tài)、數(shù)目進(jìn)行比較分析(圖2)。

圖2 獲能后上浮精子數(shù)和IVF所得卵裂率、囊胚率比較

結(jié)果表明，不同批號(hào)，不同批次精子的數(shù)目相差很大，而相對(duì)應(yīng)精子所做IVF所得到的卵裂率和囊胚率與精子的數(shù)目無(wú)關(guān)(P＞0.05)。結(jié)果顯示，受精前包括活率、密度等指標(biāo)在內(nèi)的精子狀態(tài)與受精后胚胎發(fā)育效率之間并不存在明顯趨勢(shì)性關(guān)聯(lián)。因此，精子的狀態(tài)并不是理想的預(yù)測(cè)其受精能力的指標(biāo)。例如，并不是直線運(yùn)動(dòng)多的、畸形率低的精子，囊胚率與卵裂率就一定高。

2.3 精子混合與單一個(gè)體精子進(jìn)行IVF，卵裂率和囊胚率的對(duì)比

不同個(gè)體的精子進(jìn)行混合，與混合前的精子，分別進(jìn)行IVF，觀察卵裂率及囊胚率(圖3)。

圖3 單獨(dú)精液和混合精液IVF結(jié)果比較

結(jié)果表明，混合精子的IVF的卵裂率分別是A+B:77.00%、C+D:67.01%、E+F:35.50%，囊胚率分別是 A+B:28.50%、C+D:22.84%、E+F:3.00%，單一個(gè)體精子所得到的IVF卵裂率分別是A:76.00%、B:61.22%、C:82.00%、D:22.12%、E:34.00%、F:53.00%囊胚率分別是 A:17.00%、B:12.24%、C:33.00%、D:4.81%、E:10.00%、F:22.00%。由此可見(jiàn)，利用單一個(gè)體的精子，與不同個(gè)體來(lái)源精子混合后的IVF卵裂率及囊胚率沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，獲能前的精子數(shù)量和狀態(tài)對(duì)獲能后的精子數(shù)量和狀態(tài)沒(méi)有顯著影響，獲能后的精子數(shù)量和狀態(tài)也不能決定IVF的囊胚率和卵裂率的高低。通過(guò)混合不同個(gè)體來(lái)源的精子并不能達(dá)到穩(wěn)定IVF胚胎發(fā)育效率的目的。有研究表明，最佳受精的精子終濃度為10×106［8］。從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，精子數(shù)量在這個(gè)范圍內(nèi)才能進(jìn)行IVF是不完全可信的。本實(shí)驗(yàn)的精子數(shù)量有個(gè)別沒(méi)有達(dá)到要求，但是所得囊胚率卻也并不低于其他組。精子數(shù)量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致IVF過(guò)程中粘附在卵母細(xì)胞表面的死精過(guò)多而影響配子的發(fā)育，有可能會(huì)導(dǎo)致囊胚率降低。當(dāng)然，過(guò)多的精子也會(huì)導(dǎo)致多精入卵。但是多精入卵也不完全是由獲能后精子的數(shù)量的多少?zèng)Q定，精子穿透透明帶的能力也是一個(gè)重要的原因。

雖然在本實(shí)驗(yàn)中獲能后精子狀態(tài)與IVF胚胎發(fā)育效率并無(wú)顯著的相關(guān)，但較好的精子狀態(tài)仍然是保證豬IVF效率的重要指標(biāo)，這種精子必須能夠進(jìn)行頂體反應(yīng)，頂體反應(yīng)是精子受精能力的重要先決條件［8，9］。本研究中所用獲能后精子狀態(tài)有一些運(yùn)動(dòng)方式為轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，并且觀察的視野范圍內(nèi)有很多畸形精子。但我們統(tǒng)計(jì)囊胚率發(fā)現(xiàn)沒(méi)有必然影響。分析原因，很有可能是因?yàn)檫@些精子中部分精子仍具有較強(qiáng)的受精能力，并且能夠進(jìn)行高效的頂體反應(yīng)。這也說(shuō)明精子濃度不一定需要達(dá)到10×106才能夠完成受精，具體的原因和內(nèi)在機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。

混合精子后，我們預(yù)期的想法是活力強(qiáng)的精子帶動(dòng)活力較差的精子加強(qiáng)上浮能力，更有利于篩選質(zhì)量高的精子，完成頂體反應(yīng)達(dá)到受精的同時(shí)，穩(wěn)定囊胚率。但是，不同個(gè)體來(lái)源精子混合后所得的囊胚率與單一個(gè)體精子的囊胚率相比沒(méi)有顯著性差異。下一步的研究，需要對(duì)其囊胚的質(zhì)量、細(xì)胞總數(shù)以及凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)行觀察與分析。

豬的IVF技術(shù)不僅是家畜體外胚胎技術(shù)體系中極其重要的環(huán)節(jié)，同時(shí)為受精機(jī)理和干細(xì)胞研究等提供了重要的研究材料。對(duì)于豬的干細(xì)胞而言，被認(rèn)為在人類疾病及藥物篩選模型、組織修復(fù)與替換中都具有極強(qiáng)的應(yīng)用潛力。但是目前真正的豬胚胎干細(xì)胞仍未建成［10～12］，而豬 IVF效率低下被認(rèn)為是主要制約因素之一［13］。所以，提高和穩(wěn)定豬IVF對(duì)未來(lái)豬的胚胎干細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展有著至關(guān)重要的作用。

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S828.3

A

1005－2739(2013)03－0016－04

2013－03－01

劉瀠蔚(1987－)，女，吉林省人，在讀碩士。E－mail:tongtong722@yahoo．cn

張林波，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊庖呱锕こ?。E－mail:cczlb@126.com