劉新穎，汪志平，于金鑫，呂蓓芬，馬麗芳，陳子元

浙江大學原子核農(nóng)業(yè)科學研究所農(nóng)業(yè)部核農(nóng)學重點開放實驗室，浙江杭州 310029

微藻因光合效率高、生長周期短、脂質(zhì)產(chǎn)率高、不占用耕地，且可高效利用多種污水和廢氣，而被國內(nèi)外公認為第三代生物液體燃料的主要生產(chǎn)者之一，并可望通過發(fā)揮其超強的生物轉(zhuǎn)化功能最終實現(xiàn)環(huán)境與能源相和諧[1-3]。布朗葡萄藻Botryococcus braunii 因其脂質(zhì)含量高(可達細胞干重85%)，而被國內(nèi)外視為具重大研究與開發(fā)前景的能源微藻之一[4-5]。與其他能源微藻一樣，建立快速、微量、可靠的脂質(zhì)含量檢測技術是開展葡萄藻種質(zhì)改良和培養(yǎng)模式優(yōu)化等研發(fā)的基礎。目前國內(nèi)外普遍采用尼羅紅熒光光譜法快速檢測微藻等生物細胞中的脂質(zhì)含量，其主要原理是當親脂性的噁嗪類染料——尼羅紅(9-(diethylamino) benzo[a]phenoxazin-5(5H)-one)

進入細胞后能與胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合并發(fā)出熒光，進而通過測定熒光強度即可表征被測樣品的脂質(zhì)含量[6-8]。該方法的原理與步驟雖簡單，但必須針對被測生物樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)等特殊性解決以下兩方面的關鍵前提問題才可能奏效。一方面，綠藻等生物堅厚的細胞壁會阻礙尼羅紅進入細胞，而胞內(nèi)尼羅紅的量不足必然會導致檢測靈敏度降低、測量值偏小[9]。近年來，Chen 等[9]研究發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜能有效輔助尼羅紅進入普通小球藻細胞。隨后，一些學者通過優(yōu)化二甲基亞砜濃度等條件，有效解決了尼羅紅不易進入微擬球藻[10]、單針藻[11]、斜生柵藻[12]、小球藻[13]、細菌[14]及酵母菌[15]等細胞的難題。另一方面，分光光度法測量要求被測樣品呈溶液或均勻懸浮液[16]，但葡萄藻等一些微藻，其細胞不同于小球藻和微擬球藻等微藻呈分散狀態(tài)，而是通常呈簇狀或集落態(tài)，這導致藻細胞不能均勻分布于檢測液中而嚴重影響測量[4]。Lee 等[17]雖于1998年就曾報道可利用尼羅紅熒光光譜法檢測葡萄藻的脂質(zhì)含量，但也許因未能有效解決上述兩方面關鍵問題，致使該方法至今尚未在葡萄藻研發(fā)中得以廣泛應用，而仍多沿用樣品用量大、前處理復雜、耗時耗力的稱重測量法[18-19]。

為此，本文擬通過超聲波技術分散葡萄藻集落、二甲基亞砜輔助尼羅紅進入藻細胞、優(yōu)化染色條件等，有效改進現(xiàn)有的尼羅紅熒光光譜法檢測布朗葡萄藻脂質(zhì)含量的方法，以期為葡萄藻育種與培養(yǎng)等研發(fā)提供快速、靈敏的脂質(zhì)含量檢測技術。

1 材料與方法

1.1 藻株與培養(yǎng)條件

B.braunii ZJU3001為本實驗室2003年從云南撫仙湖分離并純化。采用BG-11培養(yǎng)基[20]培養(yǎng)，接種時藻液的初始OD560為0.1。培養(yǎng)溫度為25℃，光暗周期比12 h∶12 h，光照強度60μmol/(m2·s)，藻液每天搖勻2～3次。試樣均采用處于對數(shù)生長期的藻液。藻細胞干重參照黃峙等[21]方法測定。

1.2 超聲波處理

取4 mL葡萄藻液轉(zhuǎn)入5 mL離心管并置于冰水浴中，設定JY92-Ⅱ型超聲儀(新芝，中國)的頻率為20 kHz，發(fā)射功率為100 W，變幅桿伸至藻液面下1 cm，以1 s/1 s (開/關)間歇處理藻液20 s。

1.3 光譜檢測

參照Wang 等[22]方法，用Ultrospec 2000型紫外?可見分光光度計(Pharmacia 公司，美國)檢測樣品在400～750 nm 的吸收光譜，其中OD560可反映藻液的藻細胞密度；參照Lee 等[17]方法，用RF-5000型熒光分光光度計(Shimadzu 公司，日本)檢測經(jīng)尼羅紅(NR)染色樣品的熒光發(fā)射光譜。將樣品置于黑體微量比色皿中，使在490 nm 激發(fā)光下掃描500～700 nm 的熒光發(fā)射光譜，并將在540～628 nm 范圍內(nèi)獲得一個特征性的發(fā)射峰，其峰值可反映藻液的脂質(zhì)熒光強度[9]。

1.4 尼羅紅染色條件的優(yōu)化

[9-13,23]，設定DMSO 終體積分數(shù)、NR 終質(zhì)量濃度以及染色時間和溫度的優(yōu)化范圍，并依次進行優(yōu)化。不同濃度的DMSO 溶液和NR 溶液分別由去離子水稀釋DMSO (分析純)和10μg/mL NR (Sigma 公司)丙酮儲液配制而成。脂質(zhì)檢測方法為：將葡萄藻液先按1.2方法進行超聲波處理，而后依次加入等體積不同濃度的DMSO 溶液和NR 溶液，充分混勻后置于黑暗的恒溫箱內(nèi)進行一定溫度和時間的染色反應，再按1.3方法檢測其熒光發(fā)射光譜。藻細胞脂質(zhì)的相對熒光強度值為染色液的相對熒光強度值分別減去NR與DMSO混合液及藻液在相應波長的相對熒光強度值。數(shù)據(jù)采用SAS 等軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄藻光譜檢測樣品的制備

在自然條件下，葡萄藻細胞通常聚集成簇，由幾十至上百個細胞組成串狀集落，因此藻細胞在培養(yǎng)液中的分散度和均勻性不佳(圖1，A-1)，影響了光譜檢測的靈敏度和穩(wěn)定性[15]。我們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，用頻率為20 kHz、發(fā)射功率為100 W 的超聲波，1 s/1 s (開/關)間歇處理藻液20 s 能有效分散集落，使細胞呈均勻分布(圖1，A-2)。處理后藻液的可見光吸收值增大了近1倍，680 nm 附近的葉綠素吸收峰更加明顯；因處理前、后藻液上清液的吸光值均幾乎為零，說明并未因超聲使細胞破碎進而導致葉綠素等色素滲漏到藻液而產(chǎn)生相應的吸收峰(圖1B)。同時，由OD560的時間驅(qū)動掃描曲線(圖1C)可知，未經(jīng)超聲波處理的藻液因細胞呈集落狀、易下沉而導致OD560從樣品放入檢測池即開始明顯波動，約40 s 后呈線性下降，至第5 min 時已只有原來起初的1/3左右；而處理后藻液的OD560能在2 min 內(nèi)保持穩(wěn)定，至第5 min 時也仍基本保持不變。對超聲波處理前、后藻液細胞干重與OD560的回歸分析結(jié)果(圖1D)顯示，處理組具有更好的重復性，且檢測靈敏度比對照組的提高了52.7%，相關性系數(shù)也由0.988提高到0.998。以上結(jié)果表明，合適的超聲波處理條件不僅能夠保持葡萄藻細胞的完整性，而且能有效分散集落細胞，使藻細胞在溶液中得以均勻懸浮，滿足了光譜檢測的要求，這為葡萄藻生物量和脂質(zhì)含量的光譜法測量打下了基礎。

圖1 超聲波處理對藻細胞狀態(tài)及光譜檢測的影響Fig.1 Effects of ultrasonic treatment on the cell states and spectrum detection.(A) Cell states.(B) Visible spectra.(C)Time driving scanning spectra at 560 nm.(D) Regression curves of dry weight and OD560 of algal samples.1:algal suspension without ultrasonic treatment;2:algal suspension with ultrasonic treatment;3:algal supernatant without ultrasonic treatment;4:algal supernatant with ultrasonic treatment.

2.2 二甲基亞砜對尼羅紅染色的輔助作用

適當濃度的DMSO可輔助NR進入藻細胞進而提高脂質(zhì)檢測的靈敏度，但其適宜濃度因藻種差異而從1%到30%不等[9-13,23]。實驗考察了DMSO 終體積分數(shù)分別為0、2%、5%、8%、15%、22%、28%時對葡萄藻脂質(zhì)含量檢測的影響，其他條件為：NR 終濃度為1.3μg/mL，40℃染色10 min。熒光發(fā)射光譜顯示(圖2)，B.braunii ZJU3001的脂熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在568 nm 附近。隨著DMSO 濃度的提高，脂發(fā)射熒光先增強后減弱，當DMSO 為5%時熒光值最大，比不加時提高了67.4%。值得注意的是，當DMSO 濃度過高(終濃度大于15%)時，不僅脂發(fā)射熒光強度減弱，而且在640 nm 附近會出現(xiàn)NR 自發(fā)熒光發(fā)射?？梢?，對于葡萄藻，DMSO能夠明顯提高其脂質(zhì)含量檢測的靈敏度，但需要確定最適濃度，濃度過高反而會對脂質(zhì)檢測產(chǎn)生不利影響。本實驗中，DMSO 終濃度以5%為佳，不宜超過15%。

圖2 二甲基亞砜質(zhì)量分數(shù)對脂質(zhì)含量檢測的影響Fig.2 Effect of DMSO concentrations on lipid content determination of B.braunii.

2.3 尼羅紅濃度對脂質(zhì)含量檢測的影響

NR 的濃度是影響其染色效果的關鍵因素，不同微藻的使用濃度差別很大(0.01～100μg/mL)，已報道綠藻的NR 終濃度一般為0.3～2.0μg/mL[9-13,17,23]。實驗考察了NR 終濃度為0.2～2.0μg/mL 時對葡萄藻脂質(zhì)含量檢測的影響，其他條件為：DMSO 終濃度為5%，40℃染色10 min。熒光發(fā)射光譜(圖3)顯示，脂熒光發(fā)射峰的波長在 NR 濃度較低時稍有紅移(555～568 nm)，而濃度較高時基本保持不變，這與胡小文等[22]報道的相似。隨NR 濃度的提高，脂發(fā)射熒光先增強后減弱，最大熒光值出現(xiàn)在終濃度為1.0μg/mL 時。當終濃度大于1.3μg/mL 時脂發(fā)射熒光逐漸減弱，NR 發(fā)射熒光逐漸增強。當終濃度為2.0μg/mL 時，NR 的熒光發(fā)射峰甚至會高于并嚴重干擾脂熒光發(fā)射峰。因此對于葡萄藻，NR 終濃度以1.0μg/mL 為佳，不宜超過1.7μg/mL。

圖3 尼羅紅濃度對脂質(zhì)含量檢測的影響Fig.3 Effect of Nile red concentrations on lipid content determination of B.braunii.

2.4 染色時間和溫度對脂質(zhì)含量檢測的影響

染色時間和溫度是影響染色效果的兩個重要因素，已報道的時間和溫度通常分別為1～10 min、25℃～40℃，條件太低時染色效果不佳，太高時則可能造成熒光淬滅[9-13,23]。如圖4所示，實驗考察了染色時間為1～30 min 及溫度為20℃～60℃時對葡萄藻脂質(zhì)含量檢測的影響。脂發(fā)射熒光強度隨染色時間的延長和溫度的提高都呈先增強后減弱的趨勢。隨染色時間延長，脂熒光發(fā)射峰波長在564～571 nm 范圍內(nèi)發(fā)生藍移，相對熒光強度在染色1 min 時最低，5 min和10 min 時顯著提高，20 min 及更長時間則顯著減弱。隨染色溫度的提高，脂熒光發(fā)射蜂的波長基本保持不變，相對熒光強度在溫度為40℃時達到最大值，而后顯著減弱，60℃時熒光值已降低了83.5%。因此，葡萄藻的染色時間和溫度以10 min、40℃為佳，這與Chen 等[9]以小球藻為材料的研究結(jié)果一致。

圖4 染色時間(A)和溫度(B)對脂質(zhì)含量檢測的影響Fig.4 Effect of staining time (A) and temperature (B) on lipid content determination of B.braunii.

2.5 藻細胞密度對脂質(zhì)含量檢測的影響

考察被測藻液的細胞密度與相對熒光強度間的相關性，不僅可檢驗測量方法的可靠性，而且可確定適于檢測的細胞密度范圍，有利于脂質(zhì)含量的準確測定和不同藻樣脂質(zhì)含量的比較研究[23]。采用上述改進方法測定不同細胞密度(OD560)藻液的相對熒光強度，并對二者進行回歸分析。結(jié)果顯示(圖5)，隨著藻細胞密度，即脂質(zhì)含量的增加，脂發(fā)射熒光強度逐漸增加，藻液OD560在檢測范圍內(nèi)(OD560為0.1～1.1)與藻液相對熒光強度呈良好的正相關關系，R2高達0.997。可見，藻液細胞密度OD560為0.1～1.1時均可利用該方法直接進行檢測。

2.6 改進方法與傳統(tǒng)方法的比較

圖5 藻細胞密度與相對熒光強度的關系Fig.5 Relationship of OD560 and relative fluorescence intensity.

表1 改進方法與傳統(tǒng)尼羅紅染色方法的比較Table 1 Comparison of modified and traditional Nile red methods

為進一步檢驗本文超聲波處理及染色條件優(yōu)化對葡萄藻脂質(zhì)檢測的效果，對改進方法(MethodⅠ)、改進方法中不包括超聲波處理(MethodⅡ)，以及Lee 等[17]的傳統(tǒng)方法(MethodⅢ)進行了比較。實驗設置6個重復，各參數(shù)及結(jié)果見表1?？梢钥闯?，改進方法的靈敏度最高，重復性也最好，相對熒光強度較其他兩種方法分別提高了12.4%和196.6%，反映重復性的相對標準偏差(RSD)分別由13.60%和10.91%降至1.84%。比較MethodⅠ和Ⅱ可以看出，利用合適的超聲條件對藻液進行前處理能夠明顯提高檢測的重復性。由圖1可知，這主要是因超聲波處理提高了藻細胞的分散度和均勻性，從而提高了藻細胞定量的準確性、光譜檢測的穩(wěn)定性和靈敏度等。比較MethodⅡ和Ⅲ可以看出，染色條件的優(yōu)化顯著提高了葡萄藻脂質(zhì)含量檢測的靈敏度(P＜0.05)。優(yōu)化的染色條件與傳統(tǒng)方法相比在體系中加入了5% DMSO，并將染色溫度由25℃提高至40℃，由前面結(jié)果可知，染色體系中加入5% DMSO 可使檢測靈敏度提高約67.4%(圖2)，而染色溫度由20℃提高至40℃僅使其提高約16.8%(圖4B)，因此主要是DMSO 的加入使靈敏度得以顯著提高。綜上可知，改進方法能更準確、靈敏地反映葡萄藻的脂質(zhì)含量。

3 討論

布朗葡萄藻是一種世界廣布的能源微藻，因能合成大量的脂類物質(zhì)而早已引起國內(nèi)外的極大關注。在已有研究中，葡萄藻脂質(zhì)含量的測定通常涉及有機試劑提取脂質(zhì)及稱重測量，進而可采用各類色譜法進行組分分離和分析。應用這一程序雖能獲得脂質(zhì)以及其含量、組成、結(jié)構(gòu)等較多信息，但必須確保脂質(zhì)提取完全，同時避免其分解和/或氧化，前處理復雜且樣品用量大，在高通量檢測方面受到明顯制約[9-10]。尼羅紅染色熒光光譜法因其靈敏、簡便的特點成為目前國內(nèi)外普遍采用的快速檢測方法，然而葡萄藻因其特殊的細胞結(jié)構(gòu)特點，導致傳統(tǒng)檢測方法的靈敏度和重復性不甚理想而尚未能在其研發(fā)中得以廣泛應用。本研究發(fā)現(xiàn)，引進超聲波技術分散葡萄藻集落細胞以及二甲基亞砜(DMSO)輔助NR 進入細胞，能夠顯著改善上述問題(表1)，尤其對于細胞聚集群體較大、細胞壁較堅厚的藻株具有重要意義。

超聲波技術在生命科學領域已得到廣泛的應用和發(fā)展，其通過空化作用產(chǎn)生沖擊波和高溫高壓，甚至產(chǎn)生電離效應和放電，導致空泡周圍的細胞的膠質(zhì)鞘、壁和質(zhì)膜的擊穿而產(chǎn)生較強的生物學效應[24]。目前在葡萄藻的研發(fā)中，超聲波技術多用于輔助脂質(zhì)的提取[17,25]，而用于制備光譜檢測樣品還鮮見報道。由圖1和表1可知，利用超聲波處理葡萄藻液能夠顯著提高細胞的分散度和均勻性，使取樣時藻細胞定量的準確性、光譜檢測的穩(wěn)定性和靈敏度得以提高，對利用光譜法準確測定葡萄藻生物量和脂質(zhì)含量起到重要作用。這一結(jié)果對其他以細胞群體狀態(tài)存在的單細胞或多細胞藻類同樣具有參考意義。

適宜的NR 染色條件是提高微藻脂質(zhì)檢測靈敏度的關鍵。本文優(yōu)化的DMSO 和NR 的終濃度分別為5%和1.0μg/mL，染色時間和溫度分別為10 min、40℃。與已報道的一些微藻的染色條件(表2)相比，DMSO 和NR 的濃度具有明顯差異。采用表2中濃度條件進行葡萄藻脂質(zhì)含量檢測時，其靈敏度僅為優(yōu)化濃度時的一半左右，濃度過高(＞15%)時還會產(chǎn)生NR 熒光發(fā)射峰而對檢測結(jié)果造成影響(圖2～3)。Doan 等[10]認為藻種間因細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)脂滴大小等差異，而導致染色條件不盡相同，這也提示在用尼羅紅熒光光譜法檢測并比較不同藻種的脂質(zhì)含量時，宜采用各自適合的染色條件。

另外，圖2～3表明，DMSO 和NR 濃度對葡萄藻脂質(zhì)檢測具有很大影響，因而它們在測量體系中的量必須盡可能準確。先前報道方法通常在藻液中加入高濃度、微小體積的NR 或DMSO[10,12-13,23]，致使加樣時的隨機誤差較大，難以準確定量。改進方法通過設定染色體系中藻液、DMSO 溶液和NR 溶液的體積比為1∶1∶1，擴大了二者的加樣體積，使檢測結(jié)果更加準確和穩(wěn)定。

綜上所述，本改進方法有助于快速、靈敏的進行布朗葡萄藻脂質(zhì)含量的測定，這對于葡萄藻優(yōu)良藻株和培養(yǎng)模式等的快速篩選，以及闡明其脂質(zhì)積累規(guī)律和機理等研究具有重要意義，為布朗葡萄藻及其他藻類的研究提供了必要的技術支撐。

表2 幾種微藻的尼羅紅染色條件Table 2 Nile red staining conditions of several microalgae

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