花鰻鱺病原菌弗氏檸檬酸桿菌的鑒定

楊方園，關(guān)瑞章，2，3，李忠琴，2，3，于海振，李秋云

(1．集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021;2．農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021;3．集美大學(xué)鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

花鰻鱺(Anguilla marmorata)為鰻鱺目(Anguilliformes)鰻鱺科(Anguillidae)鰻鱺屬(Anguilla)魚類，屬熱帶、亞熱帶江海洄游魚類，其分布范圍廣，國(guó)內(nèi)有長(zhǎng)江及閩江下游等地;國(guó)外北達(dá)朝鮮南部及日本紀(jì)州，西達(dá)東非，東達(dá)南太平洋的馬貴斯群島，南達(dá)澳大利亞南部[1]．近年來(lái)由于自然水體污染嚴(yán)重及過(guò)度捕撈，花鰻鱺野生資源量急劇下降，1988年被我國(guó)列為國(guó)家Ⅱ級(jí)野生保護(hù)動(dòng)物．花鰻鱺肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，其脂肪和蛋白質(zhì)含量都很高，有滋補(bǔ)強(qiáng)壯之功效，為食用魚類中的珍品[2]．目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于花鰻鱺病害的研究較少，主要報(bào)道了花鰻鱺的基礎(chǔ)生物學(xué)、人工養(yǎng)殖模式及養(yǎng)殖技術(shù)等[3－5]，有關(guān)花鰻鱺的細(xì)菌性病原的研究未見(jiàn)報(bào)道．2012年5月，集美大學(xué)水產(chǎn)試驗(yàn)場(chǎng)養(yǎng)殖的花鰻鱺發(fā)病，累計(jì)死亡率達(dá)到20%～25%．病鰻主要癥狀是鰓部嚴(yán)重腫脹，輕壓流出大量白色膿液，解剖后觀察鰓絲潰爛，肝臟失血，膽囊腫大，初步顯微觀察，發(fā)現(xiàn)病魚肝臟寄生大量細(xì)菌．因此，本研究擬對(duì)該病病原進(jìn)行分離、鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，以期為該病的防治提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1)試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用花鰻鱺取自位于廈門的集美大學(xué)水產(chǎn)試驗(yàn)場(chǎng)．取癥狀明顯的病鰻用于病原分離與檢測(cè);選體色正常、體表無(wú)損傷、活力良好、平均體重為(10±2)g的健康花鰻鱺用于人工感染試驗(yàn)．

2)主要試劑 普通瓊脂、M－H培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯 (TSB)(上海博微生物科技有限公司);BUG Agar(美國(guó)BIOLOG公司);藥敏紙片 (杭州天和微生物試劑有限公司);DNA抽提試劑盒 (OMEGA BIO－TEK);GYZ－15eV發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌生化編碼鑒定管 (杭州天和微生物試劑有限公司)．

1.2 方法

1)細(xì)菌分離 取典型癥狀的病鰻，酒精棉擦拭魚體，無(wú)菌解剖鰓、肝臟以及腎臟組織，劃線接種于普通培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后，挑取優(yōu)勢(shì)菌落重新劃線培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)，－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

2)人工感染試驗(yàn) 取健康花鰻鱺隨機(jī)分組，每組10尾，水箱規(guī)格83 cm×55 cm×53 cm，水深30 cm，養(yǎng)殖試驗(yàn)用水為曝氣的自來(lái)水，定時(shí)投食、充氣增氧和排污換水，養(yǎng)殖溫度控制在(27±2)℃．將從病鰻肝臟分離的優(yōu)勢(shì)菌株AMRB6接種于TSB肉湯中，28℃培養(yǎng)24 h，以涂布平板法測(cè)定的菌液濃度為1.0×109CFU/mL，用無(wú)菌生理鹽水10倍梯度稀釋，共設(shè)定5個(gè)試驗(yàn)組，感染劑量為每尾魚腹腔注射0.1 mL，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組．注射后從出現(xiàn)典型癥狀的花鰻鱺肝、腎部位進(jìn)行細(xì)菌重分離并鑒定．試驗(yàn)期間觀察并記錄各組鰻鱺的發(fā)病和死亡情況，試驗(yàn)周期為14 d．根據(jù)Reed的方法[6]測(cè)定半數(shù)致死量．

3)生理生化特征檢測(cè) 將分離所得菌株劃線于普通培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h，檢查其生長(zhǎng)情況及菌落特征，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏、芽孢染色．采用GYZ－15eV生化檢測(cè)試劑盒以及Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書對(duì)菌株進(jìn)行鑒定．

4)16S rRNA序列測(cè)定 將菌株AMRB6接種于TSB肉湯中，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取細(xì)菌DNA作為PCR模板DNA．采用陳翠珍等[7]的方法進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA的擴(kuò)增．PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物純化后送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定．將菌株的16S rRNA序列與GenBank中的已知核酸序列進(jìn)行比對(duì)，收集與該菌株同屬的其他菌株16S rRNA序列信息，采用DNA star 5.0和MEGA 5.0進(jìn)行序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建．

5)藥敏試驗(yàn) 取培養(yǎng)物均勻涂布于M－H培養(yǎng)基平板上，貼上藥敏紙片 (杭州天和微生物試劑有限公司)，30℃培養(yǎng)24 h后測(cè)抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標(biāo)[8]．

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的形態(tài)

AMRB6菌株在30℃培養(yǎng)24 h后，普通瓊脂平板上呈現(xiàn)灰白色圓形、中央隆起菌落，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)、光滑，直徑約2 mm，革蘭氏染色為陰性、短桿狀、兩端鈍圓、無(wú)芽孢，大小多為(0.5～0.9)μm×(1.2～2.0)μm．

2.2 人工感染試驗(yàn)

菌株AMRB6腹腔注射感染花鰻鱺在2 d后開(kāi)始死亡，而對(duì)照組在14 d內(nèi)均正常 (見(jiàn)表1)．花鰻鱺的發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為體色變淺，下顎磨損出血，鰭條充血，鰓部嚴(yán)重腫脹，鰓粘液增多，肝臟失血，膽囊、腎臟輕微腫大，而對(duì)照組無(wú)癥狀出現(xiàn)．取人工感染后瀕死花鰻鱺病變組織接種，可回收得到AMRB6菌株，證明其為致病菌，對(duì)花鰻鱺的半數(shù)致死量為3.2×107CFU/mL．

表1 菌株AMRB6人工感染試驗(yàn)Tab．1 Results of artificial infection test by bacterium AMRB6

2.3 菌株生理生化鑒定

菌株AMRB6有動(dòng)力、氧化酶陰性、觸酶陽(yáng)性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能利用枸櫞酸鹽、ONPG、戊糖、山梨醇，不能利用賴氨酸、鳥氨酸、側(cè)金盞花醇等．其GYZ－15eV系統(tǒng)鑒定結(jié)果 (見(jiàn)表2)顯示，菌株AMRB6為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，鑒定結(jié)果可信度為86.13%．Biolog自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定結(jié)果顯示，AMRB6菌株為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，相似性為98.6%(見(jiàn)表3)．

表2 菌株AMRB6的GYZ－15eV系統(tǒng)鑒定結(jié)果Tab.2 Identification of bacterial AMRB6 by GYZ－15eV system

表3 菌株AMRB6的Biolog鑒定結(jié)果Tab．3 Results of Biolog identification of AMRB6

2.4 16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

對(duì)菌株AMRB6進(jìn)行16S rRNA基因序列的測(cè)定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示．結(jié)果表明，菌株AMRB6的16S rRNA部分基因片段大小為1413 bp．將序列輸入GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，并利用DNA Star軟件與GenBank中相似序列進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (見(jiàn)圖2)，結(jié)果顯示其與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)(DQ010114)的同源性高于99%，二者在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚為一簇．綜合菌株AMRB6的生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析結(jié)果，可以確定該菌株為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，在GenBank中的登錄號(hào)是JX524616．

圖1 菌株AMRB616 SrRNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of 16S rRNA PCR products from the AMRB6

圖2 菌株AMRB6 16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of the AMRB6

2.5 藥敏結(jié)果

菌株AMRB6對(duì)左氧氟沙星、諾氟沙星、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、頭孢曲松等14種藥物高度敏感;對(duì)奧格門丁、多粘菌素B和頭孢他啶中度敏感;對(duì)利福平、氨芐西林、青霉素、復(fù)方新諾明、頭孢呋辛、頭孢克羅、哌拉西林等13種藥物耐藥 (見(jiàn)表4)．

3 討論

1)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)是由美國(guó)BIOLOG公司推出的微生物鑒定系統(tǒng)，包括細(xì)菌、絲狀真菌和酵母在內(nèi)的2000多種微生物，數(shù)據(jù)庫(kù)容量大、鑒定范圍寬廣、實(shí)驗(yàn)自動(dòng)化及標(biāo)準(zhǔn)化程度高，目前已成為細(xì)菌分類鑒定中常用的技術(shù)手段之一[9]．杜昕波等[10]利用Biolog系統(tǒng)對(duì)13株大腸桿菌、15株巴氏桿菌和7株金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定，并與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色、生化測(cè)定等鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明Biolog系統(tǒng)具有準(zhǔn)確、便捷等優(yōu)點(diǎn)．本研究運(yùn)用Biolog系統(tǒng)鑒定菌株AMRB6為弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)，這與常規(guī)生理生化鑒定以及構(gòu)建16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)得到的結(jié)果是一致的，從而證實(shí)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)操作標(biāo)準(zhǔn)化、快速省時(shí)、準(zhǔn)確，顯著優(yōu)于常規(guī)生理生化鑒定方法．

2)弗氏檸檬酸桿菌 (Citrobacter freundii)為腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter Werkman and Gillen)細(xì)菌．檸檬酸桿菌在自然界廣泛分布，在人類胃腸道正常寄居，為機(jī)會(huì)致病菌[11]，其中弗氏檸檬酸桿菌在適宜的條件下可引起人體腦膜炎、骨髓炎、腹瀉、尿路感染、創(chuàng)面感染和敗血癥等[12－13];該菌亦可在一定條件下引發(fā)食物中毒，造成食源性污染[14－15]．近年來(lái)，關(guān)于檸檬酸桿菌導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物患病死亡的研究也日益增多，林啟存等[16]報(bào)道了該菌引起中華鱉的出血性敗血癥，其主要癥狀為病鱉全身水腫，反應(yīng)遲鈍，鰓腺發(fā)炎充血，肝臟腫大充血，腸黏膜脫落且腸道嚴(yán)重積水，腎臟點(diǎn)狀充血;陳翠珍等[17]報(bào)道弗氏檸檬酸桿菌是造成中華絨螯蟹病死的重要病原菌之一;沈錦玉等[18]報(bào)道了該菌引起紅螯螯蝦發(fā)病;李華等[19]首次報(bào)道了弗氏檸檬酸桿菌對(duì)河蟹的致病性以及感染后引起的病理變化 ，同時(shí)探究了該菌對(duì)藥物的敏感性及生產(chǎn)中藥物治療效果;Sanz[20]報(bào)道在美國(guó)由該菌引起的虹鱒感染發(fā)?。壳瓣P(guān)于弗氏檸檬酸桿菌對(duì)鰻鱺屬的危害還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道．本研究認(rèn)為，弗氏檸檬酸桿菌是花鰻鱺的致病菌，可導(dǎo)致花鰻鱺鰭條充血，鰓部嚴(yán)重腫脹，鰓粘液增多等癥狀，人工感染試驗(yàn)證實(shí)其對(duì)健康花鰻鱺有較強(qiáng)致病性．

3)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，分離菌對(duì)左氧氟沙星、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等14種藥物高度敏感，對(duì)其他抗生素中度敏感或耐藥．據(jù)余德文[21]和劉明娟[22]的報(bào)道指出，不同菌株對(duì)藥物敏感性差別較大．因此通過(guò)藥敏實(shí)驗(yàn)，可以有針對(duì)性地為以后選擇用藥提供相應(yīng)的參考，以便準(zhǔn)確有效地利用藥物進(jìn)行治療．

表4 菌株AMRB6的藥物敏感性Tab．4 The antibiotic sensitivity of the bacterium AMRB6

[1]EGE V．A revision of the genus Anguilla Shaw:a systematic，phylogenetic and geographical study [J]．Dana Report，1939，16:251-256．

[2]閔志勇．花鰻鱺和日本鰻鱺肌肉生化成分的比較研究 [J]．集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1998，3(3):132-135．

[3]鄧偉霞，袁重桂，阮成，等．不同投餌率對(duì)花鰻鱺黑仔苗生長(zhǎng)的影響 [J]．福建水產(chǎn)，2011，33(2):50-52．

[4]曲煥韜，李鑫渲，王敏懿，等．花鰻鱺工廠化循環(huán)水高密度養(yǎng)殖模式初探[J]．漁業(yè)現(xiàn)代化，2009，36(4):13-16．

[5]李育培，權(quán)衡，盛曉灑．花鰻鱺的生物學(xué)特性及人工養(yǎng)殖技術(shù) [J]．漁業(yè)致富指南，2008，10(4):50-52．

[6]WARDLAW A C．Practical statistics for experimental biologists[M]．Chichester:John Wiley and Sons，1985．

[7]陳翠珍，房海，葛慕湘，等．錦鯉弗氏檸檬酸桿菌的鑒定 [J]．河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，25(4):21-25．

[8]葉應(yīng)嫵，王毓三．全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程 [M]．2版．南京:東南大學(xué)出版社，1997:553-562．

[9]張朝正，郭蘭珍，黎明，等．Biolog微生物鑒定系統(tǒng)中接種液的替代[J]．生物技術(shù)通訊，2009，20(6):836-838．

[10]杜昕波，趙耘，李偉杰，等．利用BIOLOG系統(tǒng)對(duì)不同種類細(xì)菌鑒定的研究 [J]．中國(guó)獸藥雜志，2008，42(9):31-33．

[11]王新紅，周文華．小兒枸櫞酸腸炎流行病學(xué)分析 [J]．職業(yè)與健康，2005，21(8):1192-1193．

[12]THURMV，GERICKE B．Identification of infant food as a vehicle in a nosocomial outbreak of Citrobacter freundii epidemiological subtyping by allozyme，whole-cell protein and antibiotic resistance [J]．J Appl Bacteriol，1994，76:553-558．

[13]劉旭忠，詹貞芳，宋智盛．弗氏檸檬酸桿菌引起關(guān)節(jié)炎1例 [J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17(9):1078．

[14]ALLER S C，CHUSID M J．Citrobacter koseri pneumonia and meningitis in an infant[J]．J Infect，2002，45:65-68．

[15]周聯(lián)，張希圣．一起弗氏檸檬酸桿菌引起的食物中毒 [J]．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2002，29(5):678-680．

[16]林啟存，朱麗敏．中華鱉弗氏檸檬酸桿菌敗血癥病原分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J]．水產(chǎn)科學(xué)，2008，27(1):42-43．

[17]陳翠珍，張曉君．中華絨螯蟹病原弗氏檸檬酸桿菌的鑒定 [J]．中國(guó)人獸共患病雜志，2006，22(2):136-141．

[18]沈錦玉，顧志敏，潘曉藝，等．紅螯螯蝦弗氏檸檬酸桿菌病病原的分離與鑒定 [J]．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2005，12(2):197-200．

[19]李華，刑殿樓，白國(guó)福，等．弗氏檸檬酸桿菌對(duì)河蟹致病性的研究[J]．水生生物學(xué)報(bào)，2001，2(3):217-223．

[20]SANZ F．Rainbow trout mortalities associated with a mixed infection with Citrobacter freundii and IPN virus[J]．Bulletin of the European Association of Fish pathologists，1991，11:222．

[21]余德文．弗勞地枸緣酸桿菌敗血癥10例報(bào)告 [J]．云南醫(yī)藥，1991，12(4):348-349．

[22]劉明娟．枸緣酸桿菌腸炎26例臨床分析[J]．實(shí)用兒科臨床雜志，1991，6(3):128-129．