楊瑩瑩，陳媚，鄺毓姍，葉利明，張文勝

(1.山西省醫(yī)藥與生命科學研究院，山西太原 030006;2.石家莊制藥集團歐意藥業(yè)有限公司，河北石家莊 050051;3.四川大學華西藥學院，四川成都 610041;4.四川大學華西醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學中心麻醉與危重急救研究室，四川成都 610041)

苯磺酸阿曲庫銨(atracurium besilate)是一種新型中等時效的非去極化肌松藥，為苯肼異喹啉類化合物，主要用于各種手術(shù)麻醉時維持骨骼肌的松弛或控制呼吸，尤其適用于插管時或剖宮產(chǎn)術(shù)時肌肉松弛的維持［1］;由于阿曲庫銨起效快，作用時間短，不因病人肝腎功能的損害而改變藥物的作用時間，因而得到國內(nèi)各大醫(yī)院的廣泛使用。苯磺酸阿曲庫銨有順-順、順-反、反-反3種立體異構(gòu)體，3種異構(gòu)體均有很強的肌肉神經(jīng)阻斷作用，但作用程度有所差別。臨床上常用的有注射用苯磺酸阿曲庫銨、注射用順苯磺酸阿曲庫銨，其中注射用苯磺酸阿曲庫銨為3種異構(gòu)體的混合物，三者的相對含量分別為55.0%～60.0%、34.5%～38.5%及5.0%～6.5%［2］;注射用順苯磺酸阿曲庫銨，為順式旋光異構(gòu)體，肌松強度為阿曲庫銨的3倍左右，近幾年得到了較廣泛的應用。在阿曲庫銨藥代動力學研究中，常需測定阿曲庫銨的血藥濃度，以指導臨床用藥。因此建立靈敏、快速地測定阿曲庫銨血藥濃度的方法有重要的意義。另外，阿曲庫銨在生理pH 值及堿性條件下易發(fā)生霍夫曼清除，其主要降解產(chǎn)物為勞丹堿。勞丹堿呈脂溶性，比阿曲庫銨更容易穿越血腦屏障，具有誘發(fā)驚厥的作用。驚厥可導致呼吸、心搏驟停及不同程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如果處理不當，可導致昏迷甚至死亡。因此在麻醉手術(shù)中對勞丹堿進行藥物濃度的監(jiān)測對阿曲庫銨的合理用藥具有一定的指導意義。

目前國外有采用液相色譜-熒光檢測法［3-5］或質(zhì)譜法［6-8］測定血漿中阿曲庫銨及其代謝產(chǎn)物勞丹堿的報道;國內(nèi)關(guān)于血漿中阿曲庫銨的測定多為液相色譜-紫外法［9］或熒光法［10-12］，而關(guān)于勞丹堿的檢測未見報道。本研究以注射用苯磺酸阿曲庫銨為研究對象，建立了高效液相色譜-熒光檢測(HPLCFLD)測定狗血漿中阿曲庫銨和勞丹堿濃度的方法。該方法可將3種異構(gòu)體良好分離，方法的選擇性好、靈敏度高、重復性好，已應用于體外循環(huán)下狗體內(nèi)阿曲庫銨的藥代動力學研究及勞丹堿的血藥濃度監(jiān)測，能較好地滿足要求。此外，本研究還利用該方法對注射用順苯磺酸阿曲庫銨進行了考察，該方法亦可用于注射用順苯磺酸阿曲庫銨的體內(nèi)分析。

1 實驗部分

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，配Waters 2475型熒光檢測器(美國Waters 公司);Biofuge Primo 高速離心機(德國Kendro 公司);MSI Minishake 旋渦混合器(德國IKA 公司);ME215S 電子天平(德國Sartorius 公司);Milli-Q 純水機(美國Millipore 公司)。

1.2 藥品與試劑

阿曲庫銨苯磺酸鹽對照品(純度98.2%，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);勞丹堿對照品(純度99%，美國Sigma 公司);注射用苯磺酸阿曲庫銨、注射用順苯磺酸阿曲庫銨(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);鹽酸維拉帕米注射劑(內(nèi)標，上海禾豐制藥有限公司);二氯甲烷、甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia 公司);K2HPO4、NaOH、NaH2PO4、H3PO4均為國產(chǎn)分析純;實驗用水為去離子純化水。

1.3 溶液的配制

阿曲庫銨標準儲備液:精密稱取阿曲庫銨苯磺酸鹽對照品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，以0.1 mmol/L 鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，得1.0 g/L的標準儲備液，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

勞丹堿標準儲備液:精密稱取勞丹堿對照品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，以0.1 mmol/L 鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，得1.0 g/L的標準儲備液，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標溶液:精密量取維拉帕米注射劑適量，用水稀釋至10 mg/L 作內(nèi)標溶液，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm ×4.6 mm，5μm);柱溫:25℃;流動相:0.03 mol/L 磷酸氫二鉀(用磷酸調(diào)pH 值至5.0)-乙腈(72∶28，v/v)，以0.45μm 微孔濾膜過濾;流速:1.0 mL/min;熒光檢測波長:激發(fā)波長(λEx)為240 nm，發(fā)射波長(λEm)為320 nm;進樣量:20μL。

1.5 樣品預處理

取肝素抗凝的狗全血2 mL，采血管中提前加入2 mol/L 硫酸40μL(使血漿的pH 值約為4.0)，防止藥物降解，于3500 r/min 下離心10 min 后，取血漿約1 mL，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述血漿樣品0.2 mL 于離心管中，加入內(nèi)標溶液50μL，混勻，然后加1 mol/L NaH2PO4(pH 5.5)0.5 mL，混勻后加1 mL 二氯甲烷，混旋萃取5 min，于3500 r/min 下離心5 min，取下層有機相于另一離心管中，室溫下用氮氣流吹干;殘渣用200μL 流動相溶解，取20μL 進樣測定。

1.6 定性與定量

在相同的條件下，將樣品色譜圖與阿曲庫銨和勞丹堿標準溶液的色譜圖對照，根據(jù)保留時間確定樣品中各組分的色譜峰;由于注射用阿曲庫銨中反-反異構(gòu)體和順-反異構(gòu)體含量較低，且3種異構(gòu)體的含量比例一定，故測定時以順-順阿曲庫銨的峰面積計算。在標準溶液與樣品進樣量相同的情況下，應用內(nèi)標法定量，計算樣品中各物質(zhì)的含量。比例及緩沖鹽的pH 值進行優(yōu)化，最終選用1.4節(jié)中的色譜條件，各峰峰形和分離情況均較好，且不受內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。圖1為空白血漿、空白血漿中添加對照品以及含藥血漿樣品的HPLC-FLD 譜圖，由此可見，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿曲庫銨及勞丹堿的測定。勞丹堿、順-順阿曲庫銨和維拉帕米的保留時間分別為2.8、12.7和21.2 min。

圖1 (a)空白血漿、(b)空白血漿添加對照品和(c)含藥血漿樣品的HPLC-FLD 譜圖Fig.1 Chromatograms of(a)a blank plasma sample，(b)a blank plasma sample spiked with standards and(c)a plasma sample with the drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備方法的選擇

由于阿曲庫銨在生理溫度及pH 值條件下穩(wěn)定性較差，進入生物體后很快會發(fā)生霍夫曼消除，降解為勞丹堿，故采血管內(nèi)必須提前加入硫酸，使血樣呈酸性，防止采血后阿曲庫銨繼續(xù)降解。文獻報道的樣品制備方法有固相萃?。?，7］、蛋白質(zhì)沉淀［4，10］、液-液萃取［6，9］等方法，但固相萃取法操作復雜而且成本較高，故本研究考察了蛋白質(zhì)沉淀、液-液萃取兩種提取方法。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀方法雖操作簡單，但該方法需將樣品稀釋，阿曲庫銨的檢出限勉強可以滿足實驗要求，但勞丹堿的檢出限卻無法滿足需要。本文采用液-液萃取法，考察了不同有機溶劑、溶劑體積以及提取時間對待測物提取效率的影響，最后選用提取效率高的二氯甲烷為提取溶劑，并濃縮提取液。該提取方法成本低、操作簡便且靈敏度高，可以滿足樣品測定需求。

2.2 pH 值對樣品提取回收率的影響

肌肉松弛藥屬弱堿性胺類，通常以鹽形式存在，在萃取過程中緩沖液的pH 值對藥物的提取回收率有較大的影響。文獻［5-7］采用pH 為5.0、5.4、6.0的緩沖試劑。本文考察比較了pH 值為4.5、5.0、5.5、6.0的緩沖液對待測物回收率的影響，結(jié)果顯示pH 為5.5時阿曲庫銨的提取效率最高，故選用pH 5.5的NaH2PO4溶液(1 mol/L)為提取緩沖液。

2.3 熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長的選擇

以流動相為空白調(diào)零，取1.0 g/L 阿曲庫銨標準溶液進樣，采用手動停流技術(shù)，在熒光檢測器上通過對阿曲庫銨的激發(fā)光譜(200～450 nm)和發(fā)射光譜(250～650 nm)掃描，分別得到最大激發(fā)波長240 nm和最大發(fā)射波長320 nm。

2.4 色譜條件的選擇

文獻［11］報道測定順阿曲庫銨時流動相采用0.05 mol/L 磷酸二氫鉀(pH 3.0)-乙腈(50∶50，v/v)，由于順阿曲庫銨中不含其他異構(gòu)體，色譜峰較易分離，故分析時間較短。但是在上述條件下無法達到阿曲庫銨中3種異構(gòu)體的分離，故對流動相的

2.5 線性范圍和檢出限

取空白狗血漿0.2 mL，分別加內(nèi)標液50μL，加1 mol/L NaH2PO4(pH 5.5)0.5 mL，加入阿曲庫銨和勞丹堿的標準儲備液配制成含阿曲庫銨25、50、100、250、1000、2500、5000μg/L 以及含勞丹堿25、50、100、500、1500、3000、6000μg/L的含藥血漿，按1.5節(jié)中血漿樣品處理方法處理后進樣，分別測得阿曲庫銨、勞丹堿和內(nèi)標的峰面積。以待測物的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標，分別以順-順阿曲庫銨對內(nèi)標的峰面積比(y)、勞丹堿對內(nèi)標的峰面積比(y)為縱坐標進行線性回歸，得到阿曲庫銨血藥濃度的回歸方程為y=0.0023x -0.0768，線性范圍為25～5000μg/L，r=0.9990;勞丹堿的回歸方程為y=0.0023x +0.0022，線性范圍為25～6000μg/L，r=0.9984。以信噪比為3計阿曲庫銨和勞丹堿的檢出限分別為3μg/L和1μg/L。

2.6 精密度和回收率

取空白狗血漿0.2 mL，分別配制低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控(QC)樣品，使阿曲庫銨含量分別為50、250、2500μg/L 以及勞丹堿含量分別為50、500、3000μg/L;QC 樣品每一濃度水平配制6份，按1.5節(jié)樣品處理方法操作，以當日的標準曲線計算樣品的濃度得日內(nèi)精密度;連續(xù)測定5 d，每日測定1次，得到日間精密度。對QC 樣品進行測定后，各組樣品峰面積與內(nèi)標峰面積之比代入當日標準曲線回歸方程計算質(zhì)量濃度，與加入濃度比較得方法的回收率，用以表示分析的準確度，結(jié)果見表1。由表1可見，日內(nèi)、日間精密度良好，方法的回收率在92.1%～109.5%之間。

表1 空白狗血漿中阿曲庫銨和勞丹堿的加標回收率和精密度Table 1 Recoveries and precisions(RSD)of atracurium and laudanosine spiked in a blank dog plasma sample

2.7 穩(wěn)定性

配制含阿曲庫銨低、中、高3個濃度的QC 樣品，每個濃度水平平行配制3份樣品，分別考察各濃度樣品在-20℃冰箱中保存14 d、室溫下放置7 h、反復凍融3次及按1.5節(jié)處理后室溫下放置12 h后阿曲庫銨的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，樣品中阿曲庫銨在上述條件下穩(wěn)定性良好，各組的RSD均小于10%，方法的回收率在87.8%～111.5%之間(見表2)。

表2 不同條件下狗血漿中阿曲庫銨的穩(wěn)定性(n=3)Table 2 Stability of atracurium spiked in dog plasma stored under various conditions(n=3)

2.8 在體外循環(huán)實驗中的應用

健康狼狗5只，雌雄不分，體重17～23 kg，以2.5%戊巴比妥鈉基礎(chǔ)麻醉，氣管插管后進行體外循環(huán)，注射用苯磺酸阿曲庫銨以0.8 mg/kg 劑量股靜脈注射。分別在給藥前和給藥后1、3、5、7、10、15、30、45、60、90、120和150 min 時股動脈取血約2 mL(采血管中提前加入2 mol/L 硫酸40μL，防止藥物降解)，于3500 r/min 下離心5 min 后取血漿約1 mL，按照1.5節(jié)操作測定血藥濃度，測得阿曲庫銨和勞丹堿的平均血藥濃度-時間曲線(見圖2)。通過血藥濃度-時間曲線的數(shù)學模型分析，可以得到阿曲庫銨和勞丹堿的藥動學參數(shù)，通過與非體外循環(huán)條件下藥動學參數(shù)的比較，可以制定出適合體外循環(huán)下麻醉手術(shù)的個體化給藥方案，以指導臨床合理用藥;通過勞丹堿的血藥濃度監(jiān)測可以降低手術(shù)中患者突發(fā)驚厥的可能性，為臨床安全用藥提供參考。

圖2 體外循環(huán)下狗血漿中阿曲庫銨和勞丹堿的平均血藥濃度-時間曲線Fig.2 Mean concentration-time curves of atracurium and laudanosine in dog plasma during cardiopulmonary bypass

2.9 順苯磺酸阿曲庫銨的初步考察

由于缺乏順苯磺酸阿曲庫銨對照品，故采用注射用順苯磺酸阿曲庫銨進行初步考察。取空白狗血漿0.2 mL，加入內(nèi)標液50μL、1 mol/L NaH2PO4(pH 5.5)0.5 mL、順苯磺酸阿曲庫銨溶液和勞丹堿標準液適量，配制成順阿曲庫銨約250μg/L 及勞丹堿約100μg/L的含藥血漿，按1.5節(jié)中血漿樣品處理方法處理后進樣分析。在優(yōu)化的色譜條件下，順苯磺酸阿曲庫銨與內(nèi)標均可得到良好的分離，內(nèi)源性物質(zhì)對其測定沒有干擾(見圖3)。由此可見本方法也可用于順苯磺酸阿曲庫銨的血漿樣品分析。由于樣品成分減少，分析順苯磺酸阿曲庫銨時可適當調(diào)整流動相比例，使出峰時間提前，以節(jié)省分析時間，提高工作效率。

圖3 添加順阿曲庫銨及勞丹堿的空白血漿的色譜圖Fig.3 Chromatogram of a blank plasma sample spiked with cis-atracurium and laudanosine

3 結(jié)論

本研究建立了同時測定體外循環(huán)狗血漿中阿曲庫銨和勞丹堿的高效液相色譜-熒光檢測分析方法，通過方法學驗證和實際應用，證明該方法具有靈敏度高、重復性好、操作簡便、快速、準確等優(yōu)點，適用于臨床前阿曲庫銨和勞丹堿的血藥濃度測定及其藥代動力學研究，同時為其臨床藥代動力學、藥效學研究提供了參考。

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