沈熊，陸繼偉，梁健，楊春欣，呂遷洲*

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海 200032;2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

蒽醌類化合物為大黃主要有效成分［1］，對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)的研究已有報(bào)道，其中血藥濃度測(cè)定多采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)［2］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)［3］或超高效液相色譜法(UPLC)［4］等;用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)測(cè)定大黃藥材中蒽醌的方法已有文獻(xiàn)報(bào)道［5］，但用于測(cè)定血漿中大黃活性成分尚未見報(bào)道。HPLC-FLD 具有比HPLC-UV 靈敏度高、同時(shí)又比HPLC-MS/MS 成本低的優(yōu)點(diǎn)。

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(quality by design，QbD)是由美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)引入的概念，藥品設(shè)計(jì)決定最終質(zhì)量的理念已逐漸為業(yè)界所接受［6］，并形成了與之對(duì)應(yīng)的設(shè)計(jì)模式。其主要目的為:建立設(shè)計(jì)空間(即各種影響質(zhì)量的關(guān)鍵因素及參數(shù)的范圍組合和交互作用)，并借此拓展出靈活的管理辦法。QbD 理念最初主要用于藥品制備的工藝設(shè)計(jì)，近年來(lái)，建立設(shè)計(jì)空間的概念已逐漸應(yīng)用于色譜分析等領(lǐng)域［7-9］。鑒于此，本研究嘗試采用QbD 理念，用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選影響色譜分離的主要因素，進(jìn)而選用Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化測(cè)定大鼠血漿中5種大黃蒽醌的HPLC-FLD 方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

Waters 高效液相色譜儀(1525泵，2707自動(dòng)進(jìn)樣器，1500柱溫箱，2475熒光檢測(cè)器，Breeze2色譜工作站)。對(duì)照品蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其余試劑為分析純。大黃蒽醌提取物為自制。

清潔級(jí)SD 大鼠，體重180～200 g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證號(hào):SCXK(滬)2009-0019，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1周，大黃蒽醌提取物適量口服灌胃給藥。

1.2 色譜條件

根據(jù)文獻(xiàn)［1，5］，采用Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó)菲羅門公司)，流動(dòng)相由0.1%(v/v)磷酸水溶液和甲醇組成，等度洗脫，熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為440 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為540 nm;根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，磷酸溶液pH 值為1.78～2.66，甲醇在流動(dòng)相中的體積分?jǐn)?shù)為78%～84%，流速0.8～1.2 mL/min，柱溫25～35℃，進(jìn)樣體積10～30μL。

1.3 溶液的配制和血漿樣品的預(yù)處理

混合對(duì)照品溶液:分別精密稱取5種大黃蒽醌對(duì)照品適量至25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，置4℃冰箱中保存，作為貯備液。臨用前分別吸取各貯備液適量置于同一100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即為大黃蒽醌衍生物的混合對(duì)照品溶液。

混合對(duì)照品血漿溶液:向大鼠血漿樣品(200μL)中精密加入混合對(duì)照品溶液適量，漩渦混勻，即得。

血漿樣品的預(yù)處理:根據(jù)文獻(xiàn)［3］，以3倍體積的甲醇沉淀血漿蛋白，漩渦混勻，以10000 r/min 離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL PE 管(聚乙烯管)中，在恒溫水浴(40℃)氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)尤?0μL流動(dòng)相，超聲溶解，以5000 r/min 離心3 min，取上清液作為供試品溶液。

1.4 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察5個(gè)色譜因素對(duì)4個(gè)色譜響應(yīng)值的影響。5個(gè)因素包括流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)、流速、柱溫、磷酸溶液pH 值、進(jìn)樣體積，4個(gè)響應(yīng)值為最先洗脫色譜峰(蘆薈大黃素)和相鄰雜質(zhì)間的分離度(R1)和理論塔板數(shù)(n1)、最末洗脫峰(大黃素甲醚)的保留時(shí)間(tR5)以及大黃酸的拖尾因子(T2)。各因素及水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的色譜因素、水平及響應(yīng)值Table 1 Chromatographic factors and response variables for Plackett-Burman experimental design

1.5 Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化HPLC 條件

保持以下色譜條件不變:進(jìn)樣體積20μL，激發(fā)波長(zhǎng)440 nm，發(fā)射波長(zhǎng)540 nm，0.1%(v/v)磷酸pH 值為2.20。選取流動(dòng)相中甲醇含量、流速和柱溫，分別記為A、B、C，進(jìn)行Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)，考察A、B、C 三因素對(duì)響應(yīng)值R1、n1和tR5的影響。各因素取3水平，分別記為-、0、+，設(shè)計(jì)參數(shù)見表2。

2 結(jié)果和討論

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的選擇

系統(tǒng)適用性是驗(yàn)證一個(gè)HPLC 系統(tǒng)正常運(yùn)行、結(jié)果可靠的重要標(biāo)準(zhǔn)［10］。此外，溶劑用量、分析時(shí)間以及色譜柱使用壽命等也是分析工作者關(guān)注的事項(xiàng)［11］。分析工作者須對(duì)此作出綜合評(píng)價(jià)和取舍。色譜柱類型、流動(dòng)相組成等因素及其交互作用決定了這些指標(biāo)的優(yōu)劣。系統(tǒng)適用性等硬性指標(biāo)必須符合要求，而溶劑消耗等指標(biāo)又可以根據(jù)個(gè)人習(xí)慣靈活掌握，這充分符合QbD 理念。

表2 Box-Behnken 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的參數(shù)Table 2 Optimization parameters for Box-Behnken experimental design

傳統(tǒng)的建立高效液相色譜分析的方法多采用單因素法［12，13］，其缺點(diǎn)是試驗(yàn)次數(shù)多，且不能考察因素之間的交互作用。肖文軍等［14］采用正交設(shè)計(jì)確定HPLC 方法，該方法可以考察因素間的相互作用，但正交設(shè)計(jì)是建立在因素和響應(yīng)值呈線性關(guān)系的基礎(chǔ)上，當(dāng)二者呈非線性關(guān)系時(shí)，預(yù)測(cè)性會(huì)受到影響。

響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)是近年來(lái)常用的集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的優(yōu)化方法，該方法常結(jié)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)測(cè)定最優(yōu)值［15］。最常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為中心組合設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)［8］和Box-Behnken 設(shè)計(jì)(BBD)［9］，這些方法不僅可以考察因素間的交互作用，而且適合探索二次方程的響應(yīng)面及二次多項(xiàng)式模型。其中BBD 實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，因此更為簡(jiǎn)便。同時(shí)，由于影響色譜系統(tǒng)的因素較多，因此有必要在響應(yīng)面分析之前篩選出具有顯著效應(yīng)的因素。Plackett-Burman設(shè)計(jì)(PBD)被廣泛地用于因素-主效應(yīng)的估計(jì)，PBD可以利用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，快速而有效地篩選出對(duì)結(jié)果影響顯著的因素［9］。因此，本研究采用PBD 篩選主要因素，并聯(lián)用BBD 優(yōu)化HPLC 方法。

2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)、考察因素及響應(yīng)值的選擇

本研究中流動(dòng)相的磷酸溶液pH 值在1.78～2.66之間，普通HPLC 色譜柱的pH 適用范圍在2～8之間，因此考察了可在pH 2以下使用的幾種色譜柱，結(jié)合分離度、保留時(shí)間等指標(biāo)，最終選用Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó)菲羅門公司，pH 穩(wěn)定性1.5～10)。

本研究涉及的各條件下，5種大黃蒽醌的出峰順序依次為:蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚，依次記為1～5，結(jié)構(gòu)式見圖1。隨著流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，化合物3的保留時(shí)間會(huì)迅速減小;當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)升高到85%時(shí)，化合物2和3的色譜峰出現(xiàn)部分重疊，其原因可能是由于化合物3含有3個(gè)羥基，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)提高時(shí)，其與甲醇形成氫鍵的可能性也提高，從而加快了洗脫速率。以化合物3和2的分離度R3＞1.5為標(biāo)準(zhǔn)，確定甲醇體積分?jǐn)?shù)的最高水平為84%;又以化合物5的出峰時(shí)間＜30 min 為標(biāo)準(zhǔn)，確定甲醇體積分?jǐn)?shù)的最低水平為78%。

圖1 5種測(cè)定物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the five investigated compounds

根據(jù)文獻(xiàn)［1］，確定流動(dòng)相中磷酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為0.1%，測(cè)得pH 約為2.20，因此分別取pH 1.78和2.66作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的“低”和“高”水平。

色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子和重復(fù)性等4個(gè)參數(shù)［16］，本研究選取前三者作為響應(yīng)值。此外，分析時(shí)間也是分析工作者經(jīng)常考慮的因素，縮短分析時(shí)間，可以節(jié)約溶劑和提高工作效率，因此選取最末洗脫峰的保留時(shí)間tR5作為第4個(gè)考察指標(biāo)。

對(duì)于同時(shí)測(cè)定多個(gè)組分的色譜分析而言，考察每個(gè)組分對(duì)應(yīng)的各響應(yīng)值不僅工作量大，而且也沒有必要。參考“木桶理論(Cannikin Law)［17］”并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究選取每一類指標(biāo)中“最弱”的一項(xiàng)進(jìn)行考察，當(dāng)該項(xiàng)指標(biāo)符合要求時(shí)，則同類指標(biāo)均能符合標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，化合物1的理論塔板數(shù)n1最低，因此選取n1以考察理論塔板數(shù);大鼠血漿中的極性成分會(huì)影響最先洗脫的化合物1的分離，而其他相鄰組分在本文所述條件下分離度均大于1.5，因此選取化合物1和相鄰雜質(zhì)的分離度R1考察分離度;同理選取化合物2考察拖尾因子(T2)。

2.3 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果顯示，具有顯著意義(p＜0.05)的色譜因素包括流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)、流速和柱溫。各因素對(duì)拖尾因子T2均無(wú)顯著性影響(p ＞0.05)，因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中不再考察拖尾因子;流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其他3個(gè)響應(yīng)值的影響最為顯著。

2.4 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇R1、n1及tR5為響應(yīng)值，對(duì)A、B和C 3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立因素和響應(yīng)值關(guān)系的二次方程:Y=β0+β1A+β2B+β3C +β12AB +β13AC +β23BC +β11A2+β22B2+β33C2，其中Y 為響應(yīng)值，βi代表不同的回歸系數(shù)。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸和方差分析，結(jié)果如表3所示，可見因素A 對(duì)R1、n1和tR5均具有顯著影響;因素B 對(duì)tR5、因素C 對(duì)R1也有顯著影響。為簡(jiǎn)化方程求解，在保證擬合度的前提下，進(jìn)行了相應(yīng)的方程簡(jiǎn)化，在p＜0.1水平上拒絕無(wú)顯著相關(guān)的項(xiàng)目后，諸響應(yīng)值與實(shí)驗(yàn)因素的擬合方程列于表4。

表3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance(ANOVA)results for Box-Behnken design

表4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的響應(yīng)模型和統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 4 Response models and statistical parameters obtained from ANOVA for Box-Behnken design

建立響應(yīng)面和等高線圖(圖2)以直觀分析各因素及其相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線圖中曲線的彎曲程度反映模型的非線性程度。結(jié)果顯示，當(dāng)柱溫恒定時(shí)，流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)增大，R1呈近似線性的下降，而流速對(duì)R1影響不明顯;tR5隨甲醇體積分?jǐn)?shù)和流速的增大呈線性下降;結(jié)合表4，各因素對(duì)n1的影響呈二次多項(xiàng)式模式，而因素間的交互作用對(duì)其影響不顯著(p ＞0.05)。

用Derringer 渴求函數(shù)(desirability function)評(píng)價(jià)各響應(yīng)值的綜合作用，其公式如下:

圖2 各考察因素對(duì)響應(yīng)值影響的響應(yīng)面(3D)和等高線圖Fig.2 Response surfaces(3D)and contour plots showing the effects of examined factors on responses

其中，pi 為響應(yīng)值的權(quán)重，本文權(quán)重取1，n 為響應(yīng)值的數(shù)目，di為單個(gè)響應(yīng)值的渴求函數(shù)。D 值在0～1之間;D 值越接近1則說明所確定的最優(yōu)條件越接近全局最優(yōu)條件。本研究設(shè)響應(yīng)值目標(biāo)為:n1＞3000，R1＞1.5，tR5取最小值，利用Design-Expert 7.0軟件整合渴求函數(shù)計(jì)算的功能，得最大化總體渴求值(D)為0.81，相對(duì)文獻(xiàn)［1］提高了19.1%。因素的最佳水平組合為:流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為81.4%，等度洗脫，流速為1.1 mL/min，柱溫為31℃。取供試品溶液按照最優(yōu)條件重復(fù)進(jìn)樣6次，考察實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的偏差，結(jié)果顯示偏差不超過5%，表明模型具有良好的預(yù)測(cè)性。

2.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化的色譜條件下，考察了方法的系統(tǒng)適用性。各色譜峰均能得到有效分離，見圖3。大鼠經(jīng)大黃提取物給藥后，血漿中能測(cè)到化合物1～4，其中化合物2濃度最高，而化合物5的濃度低于檢出限(LOD)，與文獻(xiàn)［3］報(bào)道一致。首先出峰的化合物1與雜質(zhì)峰的分離度不小于1.5;理論塔板數(shù)按化合物1計(jì)不低于3000。同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，5種化合物峰面積的日內(nèi)精密度(RSD)不超過2.1%。制備各被測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、LOD(S/N=3)及線性范圍見表5。

圖3 (a)5種大黃蒽醌混合對(duì)照品溶液、(b)大鼠空白血漿溶液、(c)大鼠空白血漿加對(duì)照品溶液及(d)大鼠經(jīng)大黃提取物給藥后血漿溶液的色譜圖Fig.3 Chromatograms of(a)the mixed standards，(b)a blank plasma，(c)a plasma sample spiked with the mixed standards，and(d)a plasma sample after administration of rhubarb extract

表5 血漿樣品中5種測(cè)定物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限(n=5)Table 5 Linear equations，correlation coefficients(r)，linear ranges，and limits of detection(LODs)of the five analytes in plasma sample(n=5)

3 結(jié)論

應(yīng)用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)原理，采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，建立并優(yōu)化高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定大鼠血漿中大黃蒽醌的方法。該方法準(zhǔn)確可靠，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立的模型具有良好的預(yù)測(cè)性，表明質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法可有效地應(yīng)用于優(yōu)化高效液相色譜分析方法。

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