呂東旭，　劉　凱，　劉樹發(fā)，　崔慧穎，　徐　峰

(黑龍江省佳木斯市佳木斯大學(xué) 附屬第二醫(yī)院,　佳木斯　154002)

0　引言

骨折愈合是一個(gè)非常復(fù)雜而特殊的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程，骨折修復(fù)是骨組織的再生，并最終形成十分類似于原有骨的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和特性。影響骨折愈合的因素眾多，如何加快骨折愈合的進(jìn)程一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來(lái)，隨著人們對(duì)骨折愈合機(jī)理認(rèn)識(shí)的不斷拓展，中藥治療促進(jìn)骨折愈合的方法及機(jī)制方面的研究取得了令人矚目的進(jìn)展。

黃芪作為一種重要的中藥材，迄今已有2100多年的藥用歷史，具有益氣補(bǔ)血，去毒生肌、強(qiáng)筋壯骨的功效。研究表明，黃芪具有擬雌激素樣作用，能增強(qiáng)胃腸的吸收和功能，促進(jìn)蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素如鈣、磷、鎂等吸收，促進(jìn)骨細(xì)胞再生，提高骨密度[1]。所以本實(shí)驗(yàn)基于以往理論基礎(chǔ)，選用黃芪注射液為實(shí)驗(yàn)藥物，以觀察黃芪注射液對(duì)兔下頜骨骨折愈合的影響，并探討其在促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中的作用與機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑儀器

健康新西蘭大耳白兔24只(雌雄不限)，平均體重(2.1±0.1)kg(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、黃芪注射液(哈爾濱盛泰制藥股份有限公司)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)抗體/SABC免疫組織化學(xué)試劑盒/DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、Ⅲ型X線機(jī)(日本島津公司)、BMD-400E單光子吸收骨密度檢測(cè)儀(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科)、ECLIPSE600圖像分析儀、Image Pro-plus(4.5)圖形分析軟件(日本Nikon公司)。

1.2　兔下頜骨骨折模型的制備及分組

麻醉：24只大耳白兔(術(shù)前禁食禁水12 h)，硫苯妥鈉1∶50稀釋，自兔耳緣靜脈注射麻醉，1 ml/kg。手術(shù)：完全麻醉后，輔以2%鹽酸利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉，消毒無(wú)菌條件下在左側(cè)下頜骨體部切口，暴露下頜骨體骨面，用牙科渦輪高速裂鉆自下頜骨體下緣處向上垂直造成1.5 mm×5.0 mm 的骨斷裂區(qū)域。沖洗創(chuàng)面，若無(wú)異常則分層縫合。造模后將動(dòng)物隨機(jī)分成A、B兩組(A組為實(shí)驗(yàn)組，B組為對(duì)照組)，每組12只，術(shù)后分籠飼養(yǎng)，正常喂食。A組于術(shù)后第2 d開始，按220 mg/(Kg.d)的濃度給予黃芪注射液進(jìn)行腹腔注射，1次/d，共28 d；B組為對(duì)照組，不作任何處理。兩組動(dòng)物術(shù)后均慶大霉素4萬(wàn) U 肌注，1次/d，肌注5 d，注意局部清潔，每天觀察傷口有無(wú)感染。

1.3　檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1血清骨鈣素測(cè)定

血清骨鈣素測(cè)定：術(shù)后第1、3、4 w時(shí)，每組隨機(jī)抽取4只兔，取兔耳緣靜脈血2 ml，4°C保溫箱中靜置4 h，4000 r/min離心10 min后，提取上層澄清血清液，檢測(cè)骨鈣素含量。

1.3.2骨密度檢測(cè)

將兔空氣栓塞處死，切取骨折處及兩端長(zhǎng)約3.0 cm骨標(biāo)本，用骨密度檢測(cè)儀檢測(cè)骨折縫隙處骨痂的骨密度。

1.3.3X線評(píng)分測(cè)定

對(duì)骨折處在相同條件下行X線片攝取(距離8 cm，曝光時(shí)間3 s，電壓50 kV，電流30 mA)，根據(jù)Lane 等[2]的X 線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每組骨折區(qū)骨形成、骨連接和骨塑形情況評(píng)分。

1.3.4組織學(xué)觀察

將測(cè)量完骨密度的下頜骨骨折模型置于4%多聚甲醛液中固定48 h后，20% EDTA脫鈣7 d, 乙醇梯度脫水,石蠟包埋，近遠(yuǎn)中連續(xù)切片，厚約 5 μm /片，將切片行HE染色，光鏡下觀察骨折區(qū)骨痂中軟骨生成和膠原沉積，應(yīng)用圖像分析軟件系統(tǒng)對(duì)新生骨小梁圖像進(jìn)行采集，計(jì)算每一視野中形成新骨面積百分比。免疫組化檢測(cè): 部分切片行BMP-2免疫組織化學(xué)染色，測(cè)量其灰度值。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　X線片觀察結(jié)果

術(shù)后1 w，兩組X線均顯示清晰可見(jiàn)的骨折線，但A組骨折處骨痂形成面積較B組明顯。術(shù)后3 w，A組骨折斷端已橋接，有連續(xù)骨痂形成，X線片顯示骨折線變得不清晰，形成模糊的低密度影；B組斷端剛開始橋接，骨折線仍較清晰。術(shù)后4 w，各組的骨折斷端均已橋接，骨折斷端之間密度升高，斷端附近骨膜形成，A組骨折處生成體積較大的連續(xù)骨痂，骨痂密度接近于皮質(zhì)骨，塑形良好并出現(xiàn)部分髓腔再通，骨折線基本消失，已達(dá)到骨性愈合標(biāo)準(zhǔn)；而B組的骨痂體積、密度、塑形程度等指標(biāo)均明顯低于A組，見(jiàn)圖1。術(shù)后1、3、4 w，A組X線評(píng)分均高于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見(jiàn)表1。

圖1　不同時(shí)間骨折愈合的X線圖像

組別1 w3 w4 wA1.48±0.23?4.36±0.25?6.27±0.22?B1.01±0.09 2.16±0.30 4.46±0.32

*與B組比較P<0.05

2.2　骨折處組織學(xué)觀察結(jié)果

切片HE染色后光鏡下觀察，術(shù)后1 w，A組骨折斷端可見(jiàn)新生骨痂，其中明顯可見(jiàn)過(guò)渡性骨小梁，并且邊緣有層狀排列的成骨細(xì)胞，個(gè)別處可見(jiàn)少量的成軟骨細(xì)胞和團(tuán)狀的軟骨組織，含有部分成纖維細(xì)胞和纖維性結(jié)締組織和新生毛細(xì)血管；而B組在骨折斷端僅見(jiàn)少量的新生骨痂和少量的軟骨樣組織，含有較多的成纖維細(xì)胞和纖維性結(jié)締組織。術(shù)后3 w，此時(shí)A組骨折部位處的成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞與破骨細(xì)胞同時(shí)活躍存在，大量的骨小梁進(jìn)一步增加、成熟，呈網(wǎng)狀或海綿狀；而B組的骨折部位處，骨小梁較小較細(xì)，排列稀疏，不規(guī)則，且連續(xù)性差。術(shù)后4 w，A組組骨折處的骨小梁較粗大且逐漸合并，其間較大的孔隙被新生骨充滿，骨小梁表面成排的成骨細(xì)胞大多被包裹在隱窩內(nèi)，變成骨細(xì)胞，骨基質(zhì)中的膠原纖維逐漸由不規(guī)則變?yōu)閷訝钜?guī)則排列，板層骨和編織骨存在；而B組可見(jiàn)，骨折部位的骨小梁大部分呈網(wǎng)狀或海綿狀，部分新生骨逐漸形成。

2.3　BMP-2免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后1、3、4 w，A組骨痂呈肥大型，骨化區(qū)BMP-2均呈陽(yáng)性，且4 w時(shí)BMP-2陽(yáng)性明顯，B組呈弱陽(yáng)性，見(jiàn)圖2，術(shù)后1、3、4 w，A組BMP-2免疫組化灰度值均大于B組，術(shù)后3、4w差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖2　兔下頜骨骨折愈合組織學(xué)(免疫組化×100)

2.4　骨密度測(cè)定

術(shù)后1、3、4 w，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的骨痂密度及灰度均呈逐漸增加趨勢(shì)，至術(shù)后4 w達(dá)峰值，且A組在各時(shí)間點(diǎn)的骨痂密度及灰度指標(biāo)均較B組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)各組骨密度及BMP-2免疫組織化學(xué)灰度值

*與B組比較P<0.05

2.5　血清骨鈣素測(cè)定

術(shù)后1、3、4 w，各組血清骨鈣素的水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在術(shù)后4 w均達(dá)峰值，且A組血清骨鈣素水平均相對(duì)高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3　術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)各組血清骨鈣素測(cè)定

*與B組比較P<0.05

3　討論

頜骨骨折的發(fā)生率約占頜面部損傷35%的，表現(xiàn)為咬合關(guān)系的紊亂和頜面部的畸形，以及周圍的軟組織腫脹和血管神經(jīng)的損傷，而骨折的愈合是一個(gè)影響因素眾多、非常復(fù)雜而特殊的創(chuàng)傷組織再生修復(fù)的生理過(guò)程[3-4]。如何更快、更好的修復(fù)骨折創(chuàng)傷，促進(jìn)骨折愈合，從而減少損傷對(duì)患者的生理和心理造成的影響，是學(xué)者們一直探索的重要課題。

傳統(tǒng)敘述將骨折愈合的組織學(xué)分為四個(gè)階段：炎性階段、軟骨痂階段、硬骨痂階段和再塑階段[5]，每個(gè)階段都具有很明顯的組織學(xué)和生理學(xué)特征。該過(guò)程是各種因素互相協(xié)同、互相拮抗的結(jié)果，因此評(píng)價(jià)一個(gè)藥物是否具有促進(jìn)骨折愈合的作用，應(yīng)從各方面進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)X 線片觀察顯示，黃芪注射液可增加骨折局部鈣鹽的沉積增加，并促進(jìn)骨小梁的生長(zhǎng)連接和改建，在骨痂修復(fù)期顯著加速骨痂形成，使骨痂范圍和體積擴(kuò)大，骨密度增強(qiáng)。

骨力學(xué)強(qiáng)度和骨密度有很大相關(guān)性，體現(xiàn)了骨組織的密度。所以，骨折愈合的程度主要表現(xiàn)在骨密度的變化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對(duì)骨密度的增加有促進(jìn)作用，藥物治療后兩組間及組內(nèi)均有一定差異。骨折斷端的骨密度隨時(shí)間的變化而增加，A、B兩組的骨密度差異變化明顯是在術(shù)后1 w。A組骨密度的增加在3、4 w時(shí)更明顯。血清骨鈣素與骨內(nèi)骨鈣素含量成正相關(guān)，測(cè)定血清中骨鈣素的含量不僅對(duì)了解骨生理、骨代謝瞬間變化，也對(duì)觀察成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)骨鈣素測(cè)定顯示，黃芪注射液能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞活性，加速礦化進(jìn)程，使骨形成增加。

BMP-2是公認(rèn)的最主要的骨形成調(diào)控因子[6]。BMP的主要生物學(xué)作用為誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解。軟骨細(xì)胞DNA和RNA合成并產(chǎn)生許多BMP-2，BMP-2的含量可反映成骨細(xì)胞的骨形成能力，因此，通過(guò)檢測(cè)BMP-2的分泌量就可以了解骨痂的形成情況，試驗(yàn)藥物A組在3、4 w時(shí)骨斷端的BMP-2的含量均高于B組，且差異有顯著性，說(shuō)明黃芪注射液可以促進(jìn)骨細(xì)胞的骨形成，利于骨折愈合。

綜上所述，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，黃芪注射液可以明顯增加骨折端骨痂面積、骨小梁密度及成骨細(xì)胞數(shù)量，顯著提高骨折端骨礦物含量、骨密度，促進(jìn)BMP-2蛋白的表達(dá)，從理論及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上說(shuō)明有利于骨折愈合。