陳 婷,吳繼美,李任強(qiáng)

(暨南大學(xué)生物工程學(xué)系,廣東廣州510632)

陳 婷,吳繼美,李任強(qiáng)

(暨南大學(xué)生物工程學(xué)系,廣東廣州510632)

利用QSepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜從蝦的精氨酸激酶粗提液中純化出精氨酸激酶,以其免疫大白兔,然后利用QSepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜從高免疫兔血清中純化精氨酸激酶的多克隆抗體。采用SDS-PAGE檢測(cè)精氨酸激酶及其抗體的純度,并進(jìn)行了活性測(cè)定。結(jié)果表明,利用QSepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜純化出的精氨酸激酶及其多克隆抗體純度高、活性強(qiáng)。建立了快速高效、操作方便而又適合實(shí)際應(yīng)用的制備精氨酸激酶及其多克隆抗體的方法,可為精氨酸激酶及食品過(guò)敏的相關(guān)研究提供幫助。

QSepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜;精氨酸激酶;多克隆抗體;純化

精氨酸激酶(ATP:精氨酸N-磷酸轉(zhuǎn)移酶,EC 2.7.3.3.Argininekinase,AK)是磷酸原激酶家族的一員,對(duì)于調(diào)節(jié)無(wú)脊椎動(dòng)物磷酸精氨酸與ATP之間能量的平衡具有重要作用[1],還與機(jī)體的病原識(shí)別、免疫反應(yīng)等多種重要的生理過(guò)程密切相關(guān)[2-4]。近年來(lái)的一系列研究表明,AK在肌肉組織內(nèi)大量表達(dá)[5],為甲殼類動(dòng)物體內(nèi)最重要的致敏原之一[6,7]。雖然目前對(duì)于AK的基因克隆表達(dá)、分子結(jié)構(gòu)、催化特性等的研究較多[8],但直接從甲殼類動(dòng)物中提取純化AK的報(bào)道不多,且分離純化方法普遍較繁雜、效率不高,如姚翠鸞等[9]采用CM-纖維素批量層析、SephadexG-100柱層析、DEAE-纖維素柱層析等多個(gè)步驟從凡納濱對(duì)蝦中分離純化AK。因此,若能快速高效地直接從動(dòng)物組織中純化出AK,對(duì)于開(kāi)展AK的研究是相當(dāng)有實(shí)用意義的。

作者利用QSepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜[10]分離純化AK,同時(shí),針對(duì)AK是過(guò)敏原,用純化了的AK進(jìn)行動(dòng)物免疫,并采用QSepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜對(duì)AK多克隆抗體進(jìn)行純化,從而建立了一種成本低、快速有效的制備AK多克隆抗體的方法。為海產(chǎn)品食物中基于AK過(guò)敏的相關(guān)檢測(cè)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

新西蘭大白兔,暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;刀額新對(duì)蝦(基圍蝦)購(gòu)于廣州石牌市場(chǎng)。

QSepharoseTM-XL樹(shù)脂,GEHealthcareBio-SciencesAB;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、脫脂奶粉、苯甲基磺酰氟(PMSF)、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑,Sigma公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris),廣州健陽(yáng)生物科技有限公司;其它試劑均為分析純或化學(xué)純,廣州化學(xué)有限公司。

1.2 AK的純化與活性檢測(cè)

1.2.1 AK粗提液的制備

根據(jù)Yu等[11]的方法作少量改進(jìn)。所有操作均在4℃下進(jìn)行。

取新鮮蝦肉,加入預(yù)冷的緩沖溶液A(0.1mol· L-1Tris-HCl、10mmol·L-1巰基乙醇、1mmol· L-1EDTA、5μmol·L-1NaN3、25μmol·L-1PMSF,pH值8.0),用組織搗碎機(jī)磨成勻漿;繼續(xù)加緩沖溶液A至5倍體積,抽提16h,12000r·min-1離心20min,收集上清液;上清液加硫酸銨至飽和度70%,靜置2h,12000r·min-1離心20min,取上清;繼續(xù)加硫酸銨至飽和度達(dá)90%,靜置2h,12000r·min-1離心20 min,取沉淀;用緩沖溶液B(10 mmol· L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1巰基乙醇、0.1 mmol· L-1EDTA,p H值8.0)溶解,繼續(xù)用緩沖溶液B透析,得AK粗提液。

1.2.2 AK的純化

取Q SepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行溶脹、洗滌、抽氣等處理后裝柱(20 cm×1.5 cm),連接好洗脫檢測(cè)儀(以280 nm處的光吸收值OD280監(jiān)測(cè)洗脫液),以0.5 m L·min-1流速用平衡緩沖溶液(0.02 mol·L-1Tris-HCl,p H值8.0)平衡柱子8 h以上;取5 m L AK粗提液,用平衡緩沖溶液稀釋10倍,以0.5 m L·min-1流速上樣至已平衡好的Q SepharoseTM-XL色譜柱,繼續(xù)用平衡緩沖溶液洗脫使洗脫液的OD280至基線后(趨于0),用0.1～1 mol·L-1的NaCl溶液以0.5 m L·min-1的流速進(jìn)行梯度洗脫,收集各洗脫峰;將各洗脫組分用平衡緩沖溶液透析后,真空冷凍干燥濃縮,采用還原性SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定和分子量測(cè)定。

1.2.3 AK活性的檢測(cè)

AK活性的檢測(cè)采用改進(jìn)的p H值比色法[12],在25℃下進(jìn)行。反應(yīng)液體系包括:2 mmol·L-1ATP, 10 mmol·L-1精氨酸,復(fù)合酸堿指示劑(0.15%麝香草酚藍(lán)+0.025%甲酚紅),50 mmol·L-1乙酸鎂, 50 mmol·L-1Tris-HCl,p H值8.0。取1 m L反應(yīng)液于塑料比色杯中,加入10μL酶液(樣液),迅速混合,測(cè)定1 min內(nèi)575 nm處吸收值的減少值。

1個(gè)酶活力單位定義為:在上述條件下,1 min內(nèi)AK催化磷酸精氨酸反應(yīng)產(chǎn)生1μmol H+所需的酶量。

1.3 多克隆抗體血清的制備

將純化的AK與完全弗氏佐劑等體積混合乳化,采用多點(diǎn)背部皮下注射方式對(duì)體重約3 kg的雌性新西蘭大白兔進(jìn)行免疫(500μg·只-1)[13]。共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫后從兔耳動(dòng)脈取血,采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[14]檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度,當(dāng)?shù)味确弦蠛笫占醚濉?/p>

1.4 多克隆抗體的分離純化與活性檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[10]分別進(jìn)行免疫和不免疫(陰性)血清中多克隆抗體的純化。取1.0 m L收集到的血清,用0.02 mol·L-1p H值8.0的Tris-HCl緩沖溶液稀釋至10 m L,以0.3 m L·min-1流速上樣至已平衡好的Q SepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜柱,用平衡緩沖溶液繼續(xù)過(guò)柱,收集在280 nm波長(zhǎng)處有吸收值(OD280)的洗出液,當(dāng)穿透峰的OD280降至基線時(shí),用含0.05 mol·L-1NaCl的0.02 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(p H值6.0)進(jìn)行洗脫,收集洗脫峰;當(dāng)OD280再次降至基線后,用1 mol·L-1NaCl溶液進(jìn)行洗脫并收集洗脫峰。將各洗脫液用去離子水透析后,真空冷凍干燥濃縮,分別使用非還原性SDS-PAGE和還原性SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。非還原性電泳分離膠濃度為8%,濃縮膠濃度為4%;還原性電泳分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為4%。采用電泳分析系統(tǒng)對(duì)電泳圖像進(jìn)行分析。

用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各蛋白樣品的濃度?？乖瓰锳K,以兔陽(yáng)性血清的抗體為實(shí)驗(yàn)組,兔陰性血清的抗體為對(duì)照組,通過(guò)間接ELISA檢測(cè)已純化的抗體的活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 AK的純化與活性

Q SepharoseTH-XL強(qiáng)陰離子交換色譜柱用0.1～1 mol·L-1NaCl溶液梯度洗脫,得到2個(gè)明顯的洗脫峰(圖1中峰2、3),對(duì)峰2部分進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,結(jié)果如圖2所示。

圖1 Q SepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜分離精氨酸激酶的色譜圖Fig.1 Elution profile of arginine kinase with Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography

色譜和電泳鑒定結(jié)果表明,AK粗提液中AK含量高,但雜蛋白也較多,它們都完全被吸附到Q SepharoseTM-XL色譜柱上。峰2部分雖有2條帶,但主要蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為40 ku,與AK的相對(duì)分子質(zhì)量相當(dāng),電泳密度掃描顯示其純度大于95%。因此,色譜柱分離得到的洗脫峰2是AK,純度高,達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的要求。對(duì)峰2部分進(jìn)行AK活性測(cè)定,其活力約為240 U·mg-1,具有正常的活力,進(jìn)一步驗(yàn)證了其為AK。

2.2 Q SepharoseTM-XL色譜柱對(duì)血清中Ig(抗體)的分離純化

圖2 精氨酸激酶的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE Analysis of arginine kinase

圖3 Q SepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜分離精氨酸激酶多克隆抗體的色譜圖Fig.3 Elution profile of arginine kinase polyclonal antibody with Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography

Q SepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜分離陽(yáng)性樣液得到的洗脫峰5(圖3)部分經(jīng)非還原性SDSPAGE檢測(cè)其蛋白絕大部分為一條帶(圖4a,泳道2),經(jīng)計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量約為150 ku,與相對(duì)分子質(zhì)量為150 ku的Ig相當(dāng)。同樣純化方法得到的陰性對(duì)照也與相對(duì)分子質(zhì)量為150 ku的Ig相當(dāng)(圖4a,泳道4)。而在還原性SDS-PAGE中,該蛋白呈現(xiàn)2條帶(圖4b,泳道2與4),相對(duì)分子質(zhì)量分別為50 ku和25 ku,與文獻(xiàn)報(bào)道的Ig有一條重鏈和一條輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量相符合[15],說(shuō)明洗脫峰5為AK的多克隆抗體和陰性抗體,經(jīng)電泳密度掃描分析,獲得的抗體純度在95%以上,純度較高。

圖4 血清抗體的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE Analysis of serum antibody

2.3 間接ELISA檢測(cè)Ig(抗體)的活性

為了證明所純化出的目標(biāo)物是AK抗體且具有正常活性,除了進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,還對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行活性檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可以看出,在實(shí)驗(yàn)組中,隨著純化陽(yáng)性抗體濃度的增大,其對(duì)應(yīng)的OD450逐漸增大,并呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.994。而陰性對(duì)照組中,隨著純化陰性抗體濃度的增大,其對(duì)應(yīng)的OD450一直維持在0.3,并與空白對(duì)照組(磷酸緩沖溶液)的OD450接近(數(shù)據(jù)未列出)。表明通過(guò)Q SepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜從陽(yáng)性血清中純化出的目標(biāo)蛋白就是保持正常生物活性的AK多克隆抗體。

2.4 討論

Q SepharoseTM-XL樹(shù)脂是一種高容量強(qiáng)陰離子吸附劑,以瓊脂糖凝膠Sepharose XL作為載體偶聯(lián)葡聚糖鏈、強(qiáng)Q陰離子基團(tuán)以醚鍵牢固結(jié)合于葡聚糖鏈上發(fā)揮作用。離子交換色譜是依賴于不同蛋白吸附于離子交換劑能力的不同[16]進(jìn)行純化的一種簡(jiǎn)單快捷的技術(shù),具有交換容量大、重復(fù)利用率高[17]等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)證明,對(duì)于AK粗提液,利用Q SepharoseTMXL強(qiáng)陰離子交換色譜能一步純化出高純度的AK,建立了一種快速有效、操作相對(duì)簡(jiǎn)單的直接從生物組織中分離純化AK的方法。

圖5 陽(yáng)性抗體間接ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Indirect ELISA results of purified positive antibody

目前純化抗體大多采用A蛋白親和色譜法[18-20],一般是在p H值為3的酸性條件下進(jìn)行洗脫獲得的,這類方法容易使部分抗體失活或者降低生物活性。另外,血清白蛋白(SA)和免疫球蛋白(IgG)是血清中含量最多的兩種蛋白,它們的等電點(diǎn)分別約為4.8和7.8[21],差別較大,這為利用離子交換色譜分離它們提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)先將血清中幾乎所有蛋白吸附于色譜柱上,再選擇在p H值為6.0時(shí)進(jìn)行洗脫,可將SA和IgG分開(kāi)而獲得較純的抗體(Ig),且抗體活性容易保持。本實(shí)驗(yàn)成功快速純化出了具有正?；钚缘目贵w,建立了成本低、快速高效、適合實(shí)際應(yīng)用的制備AK多克隆抗體的方法。

3 結(jié)論

在p H值8.0下,從蝦組織獲得的AK粗提液中的全部蛋白都完全被吸附到Q SepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜柱上,通過(guò)0.1～1 mol·L-1NaCl溶液的梯度洗脫,純度大于95%又有正?；钚缘腁K被單獨(dú)洗脫而得以純化。將純化的AK免疫大白兔,同樣利用Q SepharoseTM-XL強(qiáng)陰離子交換色譜柱從高免疫兔血清中分離純化出AK多克隆抗體,得到的AK多克隆抗體具有正?；钚?純度大于95%。本研究建立了快速高效、操作方便而又適合實(shí)際應(yīng)用的制備AK及其多克隆抗體的方法。

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Study on Fast Purification of Arginine Kinase and Its Polyclonal Antibody via Q SepharoseTM-XL Strong Anion Exchange Chromatography

CHEN Ting,WU Ji-mei,LI Ren-qiang
(Department of Biotechnology,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography was used to purify shrimp arginine kinase from arginine kinase crude extract.After the white rabbit was immunized using arginine kinase,the hyperimmune sera was collected and Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography was again used to purify arginine kinase polyclonal antibody from these sera.The high purity and activity of arginine kinase and its polyclonal antibody purified by Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography had been proved by SDS-PAGE.Laboratory method for fast and efficiently purification of arginine kinase and its polyclonal antibody has been built,which would be helpful for arginine kinase study and food allergies research.

Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography;arginine kinase;polyclonal antibody; purification

TQ464.7

A

1672-5425(2013)03-0067-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.018

2013-01-09

陳婷(1987-),女,湖北鄂州人,碩士研究生,研究方向:分子細(xì)胞生物學(xué);通訊作者:李任強(qiáng),教授,E-mail:trqli@jnu.edu. cn。