高效液相定量分析0.01%蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑

喬紀偉 郝紅英 姚家元 宋 彬 呂建偉

上海綠澤生物科技有限責(zé)任公司 （上海 201611）

蕓苔素內(nèi)酯（brassinolide），化學(xué)名稱（22R,23R,24R）－2α,3α,22,23－四羥基－β－均相－7－氧雜－5α－麥角甾烷－6－酮，相對分子質(zhì)量（按2007國際相對原子質(zhì)量計）為480.7，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 蕓苔素內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式

植物各個階段的生長發(fā)育是受自身激素的控制和調(diào)節(jié)的。蕓苔素內(nèi)酯作為新一類植物內(nèi)源激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和植物性激素極為相近，在很低的濃度下，能明顯地增加植物的營養(yǎng)體生長和促進受精作用、增加光合作用強度、增強根系活力、促進根系發(fā)育、提高葉綠素含量、延緩葉片衰老、抗倒伏能力增強、提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)。

有關(guān)蕓苔素內(nèi)酯的定量分析，目前尚未見公開報道。本實驗采用反相高效液相色譜，使用TC－C18為填料的不銹鋼柱和紫外檢測器，對蕓苔素內(nèi)酯進行定量分析，方法簡便、快速、準確，分離效果好，方法的準確度及精密度均能達到定量分析的要求，適用工業(yè)化生產(chǎn)和質(zhì)量分析。

1 實驗部分

1.1 試劑和溶液

吡啶：分析純；1－萘硼酸：97%分析純；乙腈：色譜純；水：新蒸二次蒸餾水；蕓苔素內(nèi)酯標樣：質(zhì)量分數(shù)98.0%（市售）；0.01%蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑（由某企業(yè)提供）。

1－萘硼酸溶液：稱取0.04g（精確至0.1mg）1－萘硼酸于100mL容量瓶中，加吡啶溶解并稀釋至刻度，搖勻。

流動相：乙腈+水＝85＋15（體積比），于超聲波浴中脫氣10min,再用0.45μm微孔濾膜過濾。

1.2 儀器

高效液相色譜儀：島津10Avp,具有可變波長的紫外檢測器；色譜數(shù)據(jù)處理機；色譜柱：250mm×4.6mm(id)不銹鋼柱，內(nèi)裝 TC－C18填充物，粒徑 5μm；微孔濾膜：0.45μm；微量進樣器：25μL；超聲波振蕩器。

1.3 色譜操作條件

流速：1.0mL/min；柱溫：40℃（溫差變化不大于2℃）；檢測波長：290nm；進樣體積：5μL；保留時間：蕓苔素內(nèi)酯異構(gòu)體1約13.0min、蕓苔素內(nèi)酯異構(gòu)體2約13.9min、蕓苔素內(nèi)酯異構(gòu)體3約15.1min、蕓苔素內(nèi)酯異構(gòu)體4約16.1min。

上述操作條件系典型操作參數(shù)，可根據(jù)不同儀器特點作適當(dāng)調(diào)整，以獲得最佳分離效果。標樣與試樣溶液高效液相色譜圖見圖2、圖3所示。

1.4 測定步驟

1.4.1 標樣溶液的配制

稱取蕓苔素內(nèi)酯標樣0.02g（精確至0.02mg），置于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。準確移取5mL標樣溶液于50mL容量瓶中，加入5mL 1－萘硼酸溶液，搖勻，于70℃反應(yīng)30min，取出，恢復(fù)至室溫后用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

1.4.2 試樣溶液的配制

稱取試樣10g（精確至0.02mg）于25mL容量瓶中，加入5mL 1－萘硼酸溶液，搖勻，于70℃反應(yīng)30min，取出，恢復(fù)至室溫后用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

標樣溶液和試樣溶液在70℃時反應(yīng)30min要同步進行。

1.4.3 測定

在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，計算各針響應(yīng)值，待相鄰兩針相對響應(yīng)值變化小于1.5%時，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.4.4 計算

將測得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標樣溶液中蕓苔素內(nèi)酯的峰面積分別進行平均。蕓苔素內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù) X（%），按式（1）計算：

式中：A1—— 標樣溶液中蕓苔素內(nèi)酯異構(gòu)體1、2、3、4峰面積之和的平均值；

A2——試樣溶液中蕓苔素內(nèi)酯異構(gòu)體1、2、3、4峰面積之和的平均值；

m1——蕓苔素內(nèi)酯標樣的質(zhì)量，g；

m2——試樣的質(zhì)量，g；

P——蕓苔素內(nèi)酯標樣的質(zhì)量分數(shù)，%；

20——稀釋因子。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

分別使用不同比例的甲醇、乙腈、水作為流動相，對試樣進行分離條件選擇，結(jié)果表明，用乙腈＋水＝85＋15（體積比）作為流動相，分離效果好，出峰時間適中，峰形對稱，滿足分析要求。

2.2 檢測波長的選擇

根據(jù)反復(fù)篩選，蕓苔素內(nèi)酯在290nm波長處有較大的紫外吸收，且在該波長下對乙腈、衍生化試劑均無吸收，確定其為測定波長。

2.3 方法的線性關(guān)系試驗

配制已知高濃度標準液經(jīng)1－萘硼酸衍生化后，移取不同濃度的標準溶液至各容量瓶中，定容至相同體積，搖勻。在1.3節(jié)表明的操作條件下進行測定，得到相應(yīng)的峰面積，見表1。

表1 蕓苔素內(nèi)酯濃度與峰面積的線性關(guān)系

以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標作圖,得到一條直線，線性關(guān)系良好，如圖4所示。得到回歸方程：Y＝3425.4X－9270.9，其相關(guān)系數(shù) r＝0.9997。

2.4 方法的精密度試驗

取一經(jīng)衍生化后的試樣，按本標準1.3節(jié)方法對同一樣品進行7次平行測定，測定相對標準偏差RSD，結(jié)果見表2。

表2 蕓苔素內(nèi)酯測定方法的精密度試驗

2.5 方法的準確度試驗

稱取已知含量的試樣及已知質(zhì)量的標準品，分別加入1－萘硼酸衍生化試劑，在70℃下保溫30min,同時取出冷卻至室溫，用移液管移取5份樣品于25mL容量瓶中，按配制值分別精確移入標準液，組成5份不同濃度的蕓苔素內(nèi)酯加標溶液，用乙腈稀釋至刻度，搖勻后按1.3節(jié)操作條件下進行測定，根據(jù)試液配制值與峰面積，分別計算5份加標液回收率，結(jié)果見表3。

表3 方法回收率試驗

3 結(jié)論

（1）根據(jù)表1所示蕓苔素內(nèi)酯濃度與響應(yīng)值線性關(guān)系，測得線性范圍在19.6～196μg/mL之間，相關(guān)系數(shù)r＝0.9997。符合CIPAC《確認農(nóng)藥制劑分析方法準則》要求，相關(guān)系數(shù)r≥0.99。

（2）根據(jù)表2所示經(jīng)7次重復(fù)測定試驗，平均值為0.0099%，依據(jù)CIPAC相對標準偏差RSD≤2(1-0.5logC)×0.67，當(dāng)濃度為0.0099%時RSD應(yīng)為2.68，實測變異系數(shù)RSD為2.27，可被CIPAC準則要求所接受。

（3）根據(jù)表3實測結(jié)果，方法回收率在98.9%～107.4%之間，CIPAC要求當(dāng)被測物濃度＜0.1%時，回收率可在75%～125%之間。此驗證結(jié)果符合CIPAC準則要求。

采用高效液相色譜法分析蕓苔素內(nèi)酯0.01%可溶液劑含量，其線性關(guān)系、精密度、準確度均符合CIPAC要求，檢測方法簡便、快速，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求。

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