李富威，張舒亞，葉軍，諶鴻超，郭云霞，印麗萍

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

木瓜，學(xué)名番木瓜（Carica papaya Linn.），俗稱木瓜，屬于番木瓜科番木瓜屬，有“百益果王”之稱，其果實肉厚清脆，營養(yǎng)全面，含有糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分。近年來，利用我國豐富的木瓜資源，開發(fā)生產(chǎn)了大量的木瓜食品，如木瓜飲料、木瓜醋、木瓜奶、木瓜酒、木瓜干片、木瓜醬、木瓜粉、木瓜脯等，深受人們的喜愛，消費量急劇增加[1]。為了追求經(jīng)濟(jì)利益，一些不法生產(chǎn)者用香精代替原果汁，不含原料成分，使果汁飲料無營養(yǎng)價值，這種制造和出售摻偽造假食品行為損害了消費者利益，擾亂了正常的市場經(jīng)濟(jì)秩序[2-4]。大多數(shù)食品經(jīng)過復(fù)雜的加工過程，無法通過外觀進(jìn)行鑒別；并且用于摻假的物質(zhì)多是與其組成接近，或某些性狀比較接近的物質(zhì)，大量的假冒偽劣食品無法通過一些傳統(tǒng)的檢測鑒偽方法鑒別真假。例如顯微鑒定通過觀察食品的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)以及內(nèi)含物的特征，鑒定食品真?zhèn)芜m用于保留了原來的動植物組織結(jié)構(gòu)的食品[5]；食品理化成分分析中常用的色譜、質(zhì)譜、光譜分析等技術(shù)很大程度上會受到原料品種、生長環(huán)境、加工條件等因素的影響，這些技術(shù)或多或少具有一定的局限性[6]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以DNA 為基礎(chǔ)的檢測方法和手段（如PCR 技術(shù)等）具有方便、準(zhǔn)確、迅速、簡潔的特點，越來越多的應(yīng)用于食品檢測中[7-9]。張舒亞等建立了食品、飼料等動物成分的鑒別研究[10-19]。Palmieri L.等研究實時熒光PCR 方法檢測果汁中桔子、草莓、藍(lán)莓、菠蘿成分[20]。Jianxun Han 等建立了果汁中葡萄、草莓、蘋果、梨、桃成分的PCR 檢測方法[21]。

國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因木瓜（番木瓜）做了大量研究，木瓜蛋白酶PAPAIN 基因作為木瓜內(nèi)參基因的研究比較成熟。本文選取了文獻(xiàn)[22-23]中的兩組引物和探針，進(jìn)行驗證、比對，最終建立了食品中的木瓜成分的實時熒光PCR 檢測方法。食品和飲料的木瓜等水果成分檢測方法的建立對于加強(qiáng)食品標(biāo)簽管理，保護(hù)消費者利益，促進(jìn)進(jìn)出口和國內(nèi)市場貿(mào)易具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

泰國木瓜、海南木瓜、都樂木瓜、轉(zhuǎn)基因木瓜KY、FP 木瓜購自上海超市。香蕉、枇杷、火龍果、棗、黑布林、蘋果、橙子、哈密瓜、獼猴桃、西柚、紅毛丹、葡萄、杏子、櫻桃、芒果、檸檬、甜瓜、桂圓、石榴、橘子、柿子、蜜梨、水蜜桃、菠蘿、大米、黃米、玉米、蕎麥、小麥、黃豆、綠豆、白云豆、腰果、花生、馬鈴薯、海帶、芹菜、西紅柿、胡蘿卜、駱駝、兔、黃牛、豬、驢、羊、馬、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、鯽魚、舌鰨、藍(lán)鰭金槍魚、帶魚等55 種常見的非木瓜動植物材料樣品購自上海超市，用于木瓜成分的特異性檢測。

在上海口岸收集進(jìn)口木瓜6 份，木瓜產(chǎn)品（果汁、果醬）10 份。在國內(nèi)市場和飯店購買木瓜4 份，產(chǎn)品（木瓜粉、木瓜果醬、木瓜酸奶、木瓜肉醬、木瓜汁飲料等）共30 份，其它未含木瓜成分的樣品50 份。用于方法的實際應(yīng)用。

DP323 動物基因組提取試劑盒、DP305 植物基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；實時熒光PCR 混合液（Taqman Gene Expression Master Mix）：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

BioPhotometer plus 核酸蛋白含量測定儀：德國Eppendorf 公司；ABI 7300 實時熒光PCR 儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；低溫冷凍高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

使用冷凍研磨機(jī)（SPEX 6850）將上述動植物樣品磨成粉狀，用于物種特異性檢測。

用小麥粉將海南木瓜粉配制成10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的預(yù)混樣品，提取DNA，進(jìn)行重量靈敏度測試。

1.2.2 DNA 提取與制備

使用天根動物基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，目錄號：DP323）提取動物樣品的DNA，使用植物基因組提取試劑盒（目錄號：DP305）提取植物樣品的DNA，提取方法詳見試劑盒操作說明書。使用BioPhotometer plus 核酸蛋白含量測定儀（Eppendorf）測定核酸濃度。

用1×TE 緩沖液將提取的海南木瓜DNA 溶液稀釋為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL，進(jìn)行DNA濃度靈敏度測試。

1.2.3 引物和探針序列

引物和探針，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物為PAGE 級，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化；探針為HPLC 級，經(jīng)高效液相層析純化。papain-91-F/papain-91-R引物序列分別為5′-AGTGGCTCAATATGGTATTCACTACAGA-3′和5′-AAAATGTAGATATACCTCCCTTGAG CG-3′，papain-91-P 探針序列為5′-FAM-ATACTTACCCATATGAGGGAGTGCAACGTTATTG-TAMRA-3′。Papain-144-F/Papain-144-R 引物序列分別為5′-GAACTGCTTGACTGCGACAGAC -3′ 和 5′ -GACCTTTCTCCCTTGAGCGAC-3′，Papain-144-P 探針序列為5′-FAMAGCTACGGGTGCAATGGAGGTTACC-TAMRA-3′。

1.2.4 PCR 反應(yīng)

使用18S rRNA 基因擴(kuò)增真核生物內(nèi)源基因，以確保所提取的DNA 適合于PCR 擴(kuò)增。檢測所用18S rRNA 基因引物序列為：5′-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3′和5′-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3′。PCR 反應(yīng)體系為：1×PCR 緩沖液，2.5 mmol/L Mg2+，1 U Taq 酶，200 μmol/L dNTPs，引物100 nmol/L，模板50 ng～100 ng，反應(yīng)體積為25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，20 s；54 ℃，40 s；72 ℃，40 s，40 個循環(huán)；72 ℃，5 min。

實時熒光PCR 采用25 μL 反應(yīng)體系：2 ×PCR 反應(yīng)預(yù)混液（ABI Taqman Gene Expression Master Mix，Part No.4369016）12.5 μL，引物（5 μmol/ L）各1 μL，探針（5 μmol/L）1 μL，模板DNA（10 ng～100 ng）1.0 μL，用去離子水補(bǔ)足體系。擴(kuò)增條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，共40 個循環(huán)。

1.2.5 PCR 產(chǎn)物的電泳檢測

18S rRNA 基因擴(kuò)增真核生物內(nèi)源基因的電泳檢測：取10 μL PCR 產(chǎn)物，加1 μL 10×上樣緩沖液點樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳圖譜。瓊脂糖凝膠濃度為2%。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核生物特異引物18S rRNA 引物的檢測結(jié)果

用真核生物18S rRNA 特異引物擴(kuò)增本實驗提取的所有DNA 溶液，除5 份未標(biāo)識含有木瓜成分的果汁（精加工）樣品和3 份木瓜汁（精加工）樣品外，所提取的DNA 溶液均能出現(xiàn)137 bp 的特異擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明，5 份未標(biāo)識含有木瓜成分的果汁（精加工）樣品和3 份木瓜汁（精加工）樣品未能有效抽提到DNA，其它樣品中抽提的DNA 溶液均適合于PCR 測試。

2.2 木瓜成分的特異性檢測結(jié)果

使用引物與探針papain-91-F/papain-91-R/papain-91-P，Papain-144-F/Papain-144-R/Papain-144-P對泰國木瓜、海南木瓜、都樂木瓜、轉(zhuǎn)基因木瓜KY、FP木瓜、香蕉、枇杷、火龍果、棗、黑布林、蘋果、橙子、哈密瓜、獼猴桃、西柚、紅毛丹、葡萄、杏子、櫻桃、芒果、檸檬、甜瓜、桂圓、石榴、橘子、柿子、蜜梨、水蜜桃、菠蘿、大米、黃米、玉米、蕎麥、小麥、黃豆、綠豆、白云豆、腰果、花生、馬鈴薯、海帶、芹菜、西紅柿、胡蘿卜、駱駝、兔、黃牛、豬、驢、羊、馬、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、鯽魚、舌鰨、藍(lán)鰭金槍魚、帶魚進(jìn)行木瓜成分特異性的檢測。檢測結(jié)果顯示，經(jīng)兩組引物和探針分別擴(kuò)增，泰國木瓜，海南木瓜，都樂木瓜，轉(zhuǎn)基因木瓜KY，F(xiàn)P 木瓜均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，在其余55 個非木瓜物種中均無擴(kuò)增，檢測結(jié)果見圖1、圖2。實驗說明這兩組引物和探針均有物種特異性。

圖1 木瓜引物papain-91-F／papain-91-R 和探針papain-91-P 特異性實時熒光PCR 檢測圖譜Fig.1 Specific detection of real-time PCR by the papain-91-F/papain-91-R/papain-91-P primer and probe

圖2 木瓜引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P 特異性實時熒光PCR 檢測圖譜Fig.2 Specific detection of real-time PCR by the papain-144-F/papain-144-R/papain-144-P primer and probe

2.3 木瓜成分的靈敏度檢測結(jié)果

用小麥粉將海南木瓜粉配制10 %、1 %、0.1 %、0.01%、0.001%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）木瓜粉樣品，并抽提DNA。使用兩組引物及探針對木瓜粉不同含量的樣品DNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示兩組引物及探針對10 %、1 %、0.1 %木瓜粉進(jìn)行檢測均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而0.01%和0.001%木瓜粉均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 木瓜引物papain-91-F/papain-91-R 和探針papain-91-P 重量靈敏度檢測圖譜Fig.3 Limit of detection by the papain-91-F/papain-91-R/papain-91-P primer and probe

圖4 木瓜引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P 重量靈敏度檢測圖譜Fig.4 Limit of detection by the papain-144-F/papain-144-R/papain-144-P primer and probe

實驗表明，在重量百分比水平上，兩組引物及探針的檢測靈敏度均為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）木瓜粉。

用1×TE 緩沖液將提取的海南木瓜DNA 溶液稀釋為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL，使用兩組引物及探針進(jìn)行實時熒光PCR 擴(kuò)增檢測。結(jié)果顯示，引物papain-91-F/papain-91-R 和探針papain-91-P 的檢測靈敏度為0.01 ng/μL 木瓜DNA，檢測結(jié)果見圖5，引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P 檢測靈敏度為0.1 ng/μL 木瓜DNA，檢測結(jié)果見圖6。在DNA 檢測水平上，引物papain-91-F/papain-91-R 和探針papain-91-P 的檢測靈敏度高于引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P。

2.4 食品中木瓜成分檢測的應(yīng)用

用兩組引物及探針對進(jìn)口和國內(nèi)市場的木瓜及產(chǎn)品進(jìn)行實時熒光PCR 檢測，6 份進(jìn)口木瓜和4 份國內(nèi)市場和飯店的木瓜中，兩組引物探針的檢測結(jié)果均為陽性；對食品標(biāo)簽中注明含木瓜成分的30 個加工食品檢測，利用引物papain-91-F/papain-91-R 和探針papain-91-P 進(jìn)行擴(kuò)增，在21 個加工食品中檢出，檢出率為70%，用引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P 進(jìn)行檢測，在18 個加工食品中檢出，檢出率為60%；兩組引物探針對50 份未含木瓜成分的樣品檢測均為陰性，檢測結(jié)果見表1。

圖5 木瓜引物papain-91-F/papain-91-R 和探針papain-91-P DNA 濃度檢測靈敏度圖譜Fig.5 Amplification curue generated by serial dilution of papaya DNA by the papain-91-F/papain-91-R/papain-91-P primer and probe

圖6 木瓜引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P DNA 濃度檢測靈敏度圖譜Fig.6 Amplification curue generated by serial dilution of papaya DNA by the papain-144-F/papain-144-R/papain-144-P primer and probe

表1 市售樣品檢測結(jié)果Table 1 Test results of commercial samples

用18S rRNA 引物檢測15 份未標(biāo)識含有木瓜成分的果汁，10 份木瓜汁DNA 出現(xiàn)137 bp 的特異性擴(kuò)增條帶，而在5 份果汁（精加工）樣品中未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。用18S rRNA 引物檢測8 份木瓜汁樣品中發(fā)現(xiàn)，5 份木瓜汁DNA 出現(xiàn)137 bp 的特異性擴(kuò)增條帶，而在3 份木瓜汁（精加工）樣品中未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，實驗表明，在5 份未標(biāo)識含有木瓜成分的果汁（精加工）樣品和3 份木瓜汁（精加工）樣品未能有效抽提到DNA，也就不能有效檢測木瓜成分。

3 結(jié)論與討論

木瓜蛋白酶PAPAIN 是番木瓜果實特有的蛋白質(zhì)，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因木瓜研究時，選擇其基因片段作為內(nèi)參基因研究較多[24-25]。本研究選用文獻(xiàn)中根據(jù)papain基因設(shè)計的兩組引物探針引物papain-91-F/papain-91-R 和探針papain-91-P、引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P，進(jìn)行木瓜成分的實時熒光PCR 檢測。本論文使用上述兩組引物探針對特異性、敏感性和市售樣品檢出情況等指標(biāo)進(jìn)行了比較研究，選出較好的引物和探針。本研究的試驗結(jié)果表明兩組引物及探針均具有物種特異性，與常見豆類、谷物、蔬菜，水果以及動物均無交叉反應(yīng)。在重量百分比水平上，兩組引物及探針的檢測靈敏度均為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）木瓜粉。在DNA 濃度靈敏度的測試中，使用引物papain-91-F/papain-91-R 和探針papain-91-P 比引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P 檢測靈敏度要高。在對市售商品檢測時，使用引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探針Papain-144-P 的檢出率比引物papain-91-F/Papain-91-R 和探針papain-91-P 略低。2 組引物探針均能應(yīng)用于食品中木瓜成分檢測。

在不含果肉的精加工木瓜果汁中未能成功提取出木瓜DNA，因木瓜果汁中DNA 的含量相對較少，果汁加工要經(jīng)過若干加工工序?qū)NA 有降解作用，DNA 的提取有一定難度，需要對其提取方法作進(jìn)一步研究。

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