劉小燕，李時悅，陳小波

(1廣州番禺區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州511400；2.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所，廣東廣州510120)

·論著·

全身熱療聯(lián)合地塞米松對大鼠肺纖維化治療作用

劉小燕1，李時悅2，陳小波2

(1廣州番禺區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州511400；2.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所，廣東廣州510120)

目的探討全身熱療聯(lián)合地塞米松對大鼠肺纖維化的治療作用。方法48只雄性SD(Sprague Dawley)大鼠隨機(jī)分為四組，即正常對照組(N組)、模型組(M組)、地塞米松治療組(D組)和全身熱療聯(lián)合地塞米松治療組(DW組)，N組氣管內(nèi)注入生理鹽水，其他三組氣管內(nèi)注入博萊霉素造模成功后分別給予相應(yīng)的治療，各組動物在第28天處死，對蘇木精伊紅染色(HE)肺組織病理結(jié)果進(jìn)行半定量評分，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測肺泡灌洗液(BALF)中IFN-γ的含量。結(jié)果DW組與D組比較，前者的纖維化程度減輕(1.250分vs 2.000分，P＜0.05)，BALF中IFN-γ的含量增高[(30.397±5.015)pg/ml vs(23.801±3.256)pg/ml，P＜0.05]。結(jié)論全身熱療可以增強(qiáng)地塞米松對大鼠肺纖維化的治療作用。

全身熱療；地塞米松；肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明的慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病，目前尚無有效的治療藥物可以延長患者的生存期。全身熱療作為一種綠色療法已廣泛應(yīng)用于腫瘤和一些良性疾病的治療上，尤其是其對化療和放療的增敏作用[1]受到大多數(shù)學(xué)者的關(guān)注，我們從這些研究中發(fā)現(xiàn)全身熱療從作用機(jī)制、細(xì)胞水平以及細(xì)胞因子水平等方面可能對治療肺纖維化有利。本試驗通過對大鼠肺組織纖維化的半定量評分和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IFN-γ含量測定，觀察全身熱療聯(lián)合地塞米松對大鼠肺纖維化的治療作用。

1 資料與方法

1.1 試劑博萊霉素針劑(日本化藥株式會社，Z50370)；地塞米松磷酸鈉注射液(山東華信制藥有限公司，H37021467)；大鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品)。

1.2 儀器DK8A恒溫水浴鍋(溫度波動：±0.1，上海精宏試驗儀器有限公司)；6801A熱電偶測溫儀(深圳市勝利高電子科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗分組、纖維化模型的建立和標(biāo)本處理

1.3.1 實(shí)驗分組和模型建立48只SD雄性大鼠，體重180～220 g，隨機(jī)分為四組，即正常對照組(N組)、模型組(M組)、地塞米松治療組(D組)和全身熱療聯(lián)合地塞米松治療組(DW組)，用1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后切開大鼠頸部皮膚，肉眼下用注射器將博來霉素按5 mg/kg劑量注入氣管[2]，N組則注入生理鹽水0.25～0.3 ml。N組和M組：造模后每日腹腔注射5%葡萄糖1 ml；D組：造模后每日按3 mg/kg劑量腹腔注射地塞米松注射液；DW組：在D組治療的基礎(chǔ)上，用水浴法給予每次1 h 40℃全身熱療(2次/周)，療程為4周。

1.3.2 標(biāo)本的獲取和處理各組大鼠于造模后第28天處死，分離出氣管和雙肺，結(jié)扎右側(cè)肺門，將氣管插管緩緩插入左主支氣管，用注射器將2.5 ml生理鹽水通過導(dǎo)管注人肺內(nèi)，然后回抽灌洗液，反復(fù)10次，最后1次回抽的灌洗液盛入15 ml的離心管，離心管置于冰浴中，重復(fù)4次上述操作。對所得標(biāo)本進(jìn)行計量，并離心10 min，上清液放入-70℃冰箱中，用于測定IFN-γ含量，取右下肺葉進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.4 大鼠肺組織纖維化半定量評分光鏡下(4×10)評估每張切片上肺纖維化的面積，使用AxioVision LE圖像信息采集系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和評分(蔡司遠(yuǎn)東有限公司)。評分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 大鼠肺纖維化組織的病理半定量評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 IFN-γ含量測定采用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ的含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，病理半定量資料采用秩和檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05即認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理半定量評分分析與M組比較，D組和DW組肺纖維化范圍和程度均減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與D組比較，DW組肺纖維化范圍和程度進(jìn)一步減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 BALF中IFN-γ含量比較支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量(pg/ml)與N組比較，M組BALF中IFN-γ含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與M組比較，D組和DW組BALF中IFN-γ含量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與D組比較，DW組BALF中IFN-γ含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同組別大鼠BALF中IFN-γ含量檢測比較

表3 不同組別大鼠BALF中IFN-γ含量檢測比較

注：aM組與N組比較，P=0.027＜0.05，DW組與N組比較，P=0.038＜0.05；bD組與M組比較，P=0.044＜0.05，DW組與M組比較，P=0.003＜0.05；cDW組與D組比較，P=0.006＜0.05。

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3 討論

全身熱療在治療腫瘤和一些良性疾病(慢性盆腔炎、前列腺肥大、痛經(jīng)等)方面的療效已經(jīng)被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可，但尚未有治療肺纖維化的相關(guān)報道。中國熱療治療專家李鼎九在對放療引起的放射性肺炎、肺纖維化患者的藥物治療觀察中發(fā)現(xiàn)，同時進(jìn)行全身熱療患者的肺纖維化程度有所減輕；張杰等[3]對33例放療引起皮下組織纖維化的患者采用微波熱療的總有效率達(dá)到87.9%。在預(yù)試驗中，我們觀察了單純熱療對大鼠肺纖維化的治療作用，發(fā)現(xiàn)肺纖維改善并不明顯，因此我們推測單獨(dú)熱療還不足以代替常規(guī)藥物達(dá)到滿意治療肺纖維化的作用，類似于熱療對腫瘤化療和放療的增敏[4]作用，若其與治療肺纖維化的藥物聯(lián)用則可能通過增強(qiáng)機(jī)體對藥物的敏感性，增加機(jī)體免疫細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)等對肺纖維化具有一定的輔助治療作用。本試驗結(jié)果表明，熱療聯(lián)合激素與單純激素治療相比，試驗大鼠的肺組織病理變化有所減輕，提示熱療對激素治療肺纖維化有一定的增強(qiáng)作用。

作用機(jī)制方面，IFN-γ主要由CD8+T細(xì)胞和某些CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，具有一定的抗纖維化作用，有研究也表明IFN-γ受體缺失可誘發(fā)大鼠纖維化[5]，而且目前IFN-γ已用于肺纖維化治療的2期、3期臨床試驗[6]，本實(shí)驗結(jié)果提示全身熱療可能通過增加IFN-γ的含量從而增強(qiáng)地塞米松對肺纖維化的治療作用。結(jié)合既往的一些研究，熱療還可能通過以下四個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用：①全身熱療時體溫升高，組織血管擴(kuò)張，加溫破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使膜的通透性增加，有利于化療藥物的滲透和吸收[1]；具有一定的熱增強(qiáng)效應(yīng)。②改善血液微循環(huán)，明顯改善肺內(nèi)的通氣/血流比例而發(fā)揮治療作用；同時血循環(huán)的改善加速了局部代謝產(chǎn)物的移除，使?jié)B出減少[7]，有利于炎癥消退以及有害細(xì)胞因子的清除。③肺纖維化的發(fā)病機(jī)制認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞因子比例失衡在纖維化的過程中發(fā)揮重要的作用[8]，洪曉軍等[9]通過研究觀察到熱療可以提高荷瘤鼠IL-2水平，熱療可刺激B淋巴細(xì)胞活化，其釋放的IFN-γ、IL-2等輔助性細(xì)胞因子(Th1類)，可糾正Th1/Th2細(xì)胞因子失衡達(dá)到治療作用。④細(xì)胞凋亡方面，IPF患者的凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)下調(diào)而Bax明顯上調(diào)[10]，在對腫瘤進(jìn)行熱療的研究中則表現(xiàn)為bcl-2表達(dá)上調(diào)而Bax成下調(diào)趨勢[4,11]。

綜上所述，我們僅從本試驗和理論推測熱療可以增強(qiáng)地塞米松對大鼠肺纖維化的治療作用，其應(yīng)用到臨床是否能發(fā)揮作用、如何應(yīng)用才能發(fā)揮最佳的療效以及其作用機(jī)制如何還有待進(jìn)一步研究和明確。

(志謝：本試驗得到中國腫瘤治療專家李鼎九教授和廣州祈福醫(yī)院孔寒夢主任的大力幫助和支持，特此感謝！)

[1]Mohamed F,Marchettini P,Stuart OA,et al.Thermal enhancement of new chemotherapeutic agents at moderate hyperthermia[J].Ann Surg Oncol,2003,10(4):463-468.

[2]高春蘇,陸倫根.纖維化疾病的基礎(chǔ)和臨床[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2004:468.

[3]張杰,郭毅,王克蘭,等.微波熱療對組織纖維化近期療效的觀察與分析[J].濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002,25(5):391.

[4]李鼎九,胡自省,鐘毓斌.腫瘤熱療學(xué)[M].鄭州:鄭州大學(xué)出版社, 2002:93-96,144.

[5]Mora AL,Torres-Gonzalez E,Roias M,et al.Control of virus reactivation arrests pulmonary herpesvirus-induced fibrosis in IFN-γreceptor-deficient mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,175 (11):1139-1150.

[6]班健.特發(fā)性肺纖維化的治療進(jìn)展[J].臨床肺科雜志,2011,16 (9):1432-1434.

[7]劉宏亮.毫米波療法的研究應(yīng)用及有關(guān)問題[J].國外醫(yī)學(xué):物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)分冊,1998,18:154-156.

[8]Kikuchi N,Ishii Y,Morishima Y,et al.Nrf2 protects against pulmonary fibrosis by regulating the lung oxidant level and Th1/Th2 balance[J].Respir Res,2010,11:31.

[9]洪曉軍,毛祖彝,王升志,等.熱化療對荷瘤鼠IL-2、TNF水平影響的研究[J].四川腫瘤防治,2002,15:65-67.

[10]Kang HR,Cho SJ,Lee CG,et al.Transforming growth factor (TGF)-beta1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent,bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12[J].J Biol Chem,2007,282:7723-7732.

[11]Zhang TJ,Hang J,Wen DX,et al.Hippocampus bcl-2 and bax expression and neuronal apoptosis after moderate hypothermic cardiopulmonary bypass in rats[J].Anesth Analg,2006,102:1018-1025.

Therapeutic effect of whole body hyperthermia combined with dexamethasone on pulmonary fibrosis in rats.

LIU Xiao-yan1,LI Shi-yue2,CHEN Xiao-bo2.1.Department of Respiratory Medicine,Guangzhou Panyu People's Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA;2.Guangzhou Institute of Respiratory Disease,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510120,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of whole body hyperthermia combined with dexamethasone in the treatment of pulmonary fibrosis in rats.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into four groups:normal group(group N),model group(group M),dexamethasone group(group D)and whole body hyperthermia combined with dexamethasone group(group DW).Fibrosis was induced in rats by intratracheal instillation of saline(group N)or bleomycin(the other groups),then each group received corresponding treatment and was put into death after 28 days.Semi-quantitative analysis of the histopathologic changes stained with hemotoxylin and eosin (HE),the concentration of IFN-γ in BALF were measured with ELISA.ResultsThe degree of fibrosis decreased (1.250 vs 2.000,P＜0.05)and the content of IFN-γ in BALF increased[(30.397±5.015)pg/ml vs(23.801±3.256)pg/ml,P＜0.05]significantly in group DW as compared with group D.ConclusionWhole body hyperthermia could enhance the treatment function of dexamethasone for pulmonary fibrosis in rats.

Whole body hyperthermia;Dexamethasone;Pulmonary fibrosis

R-332

A

1003—6350（2013）03—0316—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.03.0141

2012-07-20)

劉小燕。E-mail：liuxiaoyan1892@163.com