艾塞那肽對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型中VCAM-1、ICAM-1表達的影響

陳若然，梁琳瑯，王健美，王宇

艾塞那肽對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型中VCAM-1、ICAM-1表達的影響

陳若然，梁琳瑯，王健美，王宇

目的探討胰高血糖素樣肽1(GLP-1)受體激動劑艾塞那肽對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中主動脈病變的影響。方法 ApoE-/-小鼠隨機分為普通飲食組(n=14)和高脂飲食組(n=68)，喂養(yǎng)12周后隨機抽取普通飲食組4只和高脂飲食組8只小鼠檢測造模情況。將高脂飲食組小鼠再分為非藥物干預(yù)組、阿托伐他汀鈣片組、艾塞那肽小劑量組、艾塞那肽大劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組(每組10只)。藥物干預(yù)6周后，各組小鼠眶周靜脈叢取血，并取主動脈弓行石蠟切片，HE染色觀察。ELISA法檢測血清血脂水平，Western blotting檢測主動脈血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的蛋白表達水平。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示：普通飲食組及阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組鏡下觀察未見異常；阿托伐他汀鈣片組，艾塞那肽小、大劑量組，阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組可見廣泛的病理性內(nèi)膜增厚；非藥物干預(yù)組有脂質(zhì)斑塊形成，可見脂核。單獨應(yīng)用艾塞那肽或聯(lián)合阿托伐他汀可不同程度降低血清血脂(TC、TG、LDL-C)水平(P＜0.05)。艾塞那肽不同劑量單獨或聯(lián)合阿托伐他汀可降低主動脈VCAM-1、ICAM-1的表達(P＜0.05)。結(jié)論艾塞那肽可能通過下調(diào)ApoE-/-小鼠主動脈VCAM-1、ICAM-1的表達，抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變的形成。

艾塞那肽；動脈粥樣硬化；載脂蛋白E類；小鼠，基因敲除；血管細(xì)胞黏附分子-1；胞間黏附分子-1

[Key words]exenatide; atherosclerosis; apolipoproteins E; mice, knockout; vascular cell adhesion molecule-1; intercellular adhesion molecule-1

糖尿病患者的高糖、高脂狀態(tài)可直接影響心血管系統(tǒng)，引起心血管并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者的生命健康。動脈粥樣硬化(AS)是糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ)，而高糖、高脂在AS形成中的作用很難獨立區(qū)分[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素樣肽1(GLP-1)不僅具有血糖依賴性促胰島素分泌的降血糖作用[3]，還可減輕體重、改善血脂[4]，對心血管系統(tǒng)也有一定的保護效應(yīng)[5-6]。目前關(guān)于GLP-1對AS的直接效應(yīng)報道較少，本研究探討了GLP-1受體激動劑艾塞那肽對高脂干預(yù)的ApoE-/-小鼠AS病變的作用，旨在為防治和延緩糖尿病大血管病變提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物及飼料 SPF級雄性健康A(chǔ)poE-/-小鼠[北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SGSK(京)2009-0004]，5～7周齡，體重17～27g，分籠(5～6只/籠)喂養(yǎng)，自由進食、飲水，12h明暗交替，溫度23±2℃，濕度55%～65%。普通、高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司；高脂飼料成分為(每100g計)：普通飼料79.85g，脂肪15g，蛋黃粉5g，膽固醇0.15g，經(jīng)60鈷滅菌后真空壓縮包裝。

1.2藥物 阿托伐他汀鈣片(立普妥，輝瑞制藥有限公司)；艾塞那肽注射液(百泌達，美國禮來公司)。

1.3主要試劑 甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)抗體、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)抗體(美國R&D Systems公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo公司)；高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.4研究方法 ApoE-/-小鼠在基礎(chǔ)飼料條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，隨機分為普通飲食組(n=14)和高脂飲食組(n=68)。喂養(yǎng)12周后隨機抽取普通飲食組4只、高脂飲食組8只檢測造模情況。將其余高脂飲食組小鼠分為6組(每組10只)，即非藥物干預(yù)組、阿托伐他汀鈣片組、艾塞那肽小劑量組、艾塞那肽大劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組。阿托伐他汀鈣片劑量為10mg/(kg·d)，艾塞那肽小、大劑量分別為1.2、100μg/(kg·d)。進行相關(guān)藥物干預(yù)6周后，小鼠禁食12h，眶周靜脈叢取血，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(1mg/kg)，解剖胸主動脈弓及主動脈，一部分用4%多聚甲醛溶液固定，一部分于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1血清血脂水平檢測 TG、TC采用酶法測定，LDL-C采用選擇性沉淀法測定。

1.5.2主動脈弓石蠟切片HE染色 4%多聚甲醛溶液中已固定好的胸主動脈弓經(jīng)梯度乙醇脫水(70%、80%、90%、95%、100%)，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片(厚度4μm)，HE染色，中性樹膠封固，顯微鏡下攝片。

1.5.3Western blotting檢測主動脈中VCAM-1、ICAM-1的蛋白表達 每組分別取胸主動脈血管4根，用PBS沖洗干凈后剪碎組織，按1mg組織加入15μl預(yù)冷的裂解液(含終濃度1mmol/L的PMSF)于冰上裂解20min，收集裂解組織，4℃、13 000r/min離心15min，取上清；使用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度；常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后結(jié)合VCAM-1、ICAM-1一抗，以β-actin為內(nèi)參照，4℃孵育過夜；TBST洗膜10min×4次，加入相應(yīng)二抗，再次洗膜；與化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)PVDF膜共孵育1min，入暗室將PVDF膜與X線片于壓片盒中曝光，顯影后再定影。掃描膠片，用Quantity One軟件分析條帶光密度值，以VCAM-1、ICAM-1與β-actin條帶的光密度比值評定VCAM-1、ICAM-1蛋白表達水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用±s表示。兩樣本比較采用t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AS模型的建立 喂養(yǎng)12周后，高脂飲食組未見明顯AS斑塊形成，但可見脂質(zhì)條紋，內(nèi)膜中膜厚度較普通飲食組增厚，提示AS造模成功(圖1)。

圖1 普通飲食組和高脂飲食組主動脈弓病理形態(tài)學(xué)變化(×200)Fig.1 Pathomorphological change of aortic arch of mice in normal diet group (left) and high-fat diet group (right) (×200)

2.2血清脂質(zhì)代謝水平 非藥物干預(yù)組、阿托伐他汀鈣片組TC、LDL-C水平明顯高于普通飲食組(P＜0.05)；艾塞那肽小劑量組、艾塞那肽大劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組LDL-C水平明顯低于非藥物干預(yù)組(P＜0.05)；阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組TG水平明顯高于普通飲食組，TC、LDL-C水平明顯低于非藥物干預(yù)組(P＜0.05，表1)。

2.3各組主動脈弓病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示：普通飲食組及阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組內(nèi)膜結(jié)構(gòu)未見異常；非藥物干預(yù)組內(nèi)膜形成脂質(zhì)斑塊，可見脂核；阿托伐他汀鈣片組、艾塞那肽小/大劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組可見廣泛的病理性內(nèi)膜增厚(圖2)。

2.4動脈組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達水平比較 與普通飲食組相比，除阿托伐他汀鈣片組外，其余各組的VCAM-1表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與非藥物干預(yù)組相比，除艾塞那肽小劑量組外，其余各組VCAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與阿托伐他汀鈣片組相比，除普通飲食組外，其余各組VCAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；各藥物干預(yù)組之間VCAM-1的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與普通飲食組相比，非藥物干預(yù)組、阿托伐他汀鈣片組、艾塞那肽小劑量組、艾塞那肽大劑量聯(lián)合阿托伐他汀組ICAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與非藥物干預(yù)組相比，各組ICAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與阿托伐他汀鈣片組相比，各組ICAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；各藥物干預(yù)組之間ICAM-1的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

表1 藥物干預(yù)對ASApoE-/-小鼠血清血脂的影響(mmol/L，±s，n=10)Tab.1 Effects of drug intervention on the levels of serum lipid in ApoE-deficient mice with atherosclerosis (mmol/L,±s, n=10)

表1 藥物干預(yù)對ASApoE-/-小鼠血清血脂的影響(mmol/L，±s，n=10)Tab.1 Effects of drug intervention on the levels of serum lipid in ApoE-deficient mice with atherosclerosis (mmol/L,±s, n=10)

(1)P＜0.05 compared with normal diet group; (2)P＜0.05 compared with non-drug intervention group; (3)P＜0.05 compared with atorvastatin group

TC TG LDL-C Normal diet 8.29±2.93 1.77±0.69 2.44±1.04 Non-drug intervention 13.63±1.48(1) 2.16±0.65 6.02±1.66(1)Atorvastatin 13.46±2.37(1) 2.18±0.99 4.99±2.17(1)Exenatide low -dose 10.98±1.22 1.82±0.45 2.02±1.62(2)(3)Exenatide high-dose 9.68±3.60(2) 1.75±0.42 2.34±0.81(2)(3)Atorvastatin + exenatide low -dose 10.04±0.27 1.51±0.23 1.28±1.08(2)(3)Atorvastatin + exenatide high-dose 9.24±1.81(2)(3) 2.88±0.51(1) 0.89±0.74(2)(3)Group

圖2 各組主動脈弓病理形態(tài)學(xué)變化(HE ×200)Fig.2 Pathomorphological change of aortic arch of mice in each group (HE ×200)

3 討 論

AS是一種累及全身大、中動脈內(nèi)膜的慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿其發(fā)生發(fā)展的全過程。在高脂等致炎因子的作用下，多種黏附分子活化并與單核細(xì)胞表面受體結(jié)合，促使單核細(xì)胞黏附到損傷的內(nèi)皮上，這是AS早期病變的重要特征之一[7-8]。黏附分子在介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及其相互作用方面起到了關(guān)鍵作用，影響著AS病變的形成與發(fā)展。VCAM-1是一種介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間黏附及相互作用的膜表面糖蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及平滑肌細(xì)胞表面表達。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，可表達于白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞，尤其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達最強。ICAM-1在活性內(nèi)皮細(xì)胞上的表達是組織損傷和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[9-10]。VCAM-1和ICAM-1在抗原表達過程中可以作為淋巴細(xì)胞的共刺激信號，在AS中進一步發(fā)揮作用。

圖3 主動脈內(nèi)VCAM-1、ICAM-1的蛋白表達Fig.3 Protein expression of VCAM-1 and ICAM-1 in aorta

GLP-1是一種由腸道L細(xì)胞分泌的重要的腸促胰素，可通過以葡萄糖依賴方式促進胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，延緩胃排空，增加飽腹感等作用維持血糖的穩(wěn)定[3]。艾塞那肽是人工合成的GLP-1受體激動劑，通過與其受體特異性結(jié)合發(fā)揮作用。Arakawa等[11]研究表明，Exendin-4可顯著減少單核/巨噬細(xì)胞在血管壁上的聚集，并最終抑制AS。本研究Western blotting檢測表明，非藥物干預(yù)組小鼠全程接受高脂飼料喂養(yǎng)，VCAM-1、ICAM-1表達水平與其他組比較均顯著增加，表明在AS炎癥反應(yīng)過程中艾塞那肽單獨或聯(lián)合阿托伐他汀鈣片可抑制黏附分子的過度表達，從而減輕AS炎癥，延緩AS進程。在各藥物干預(yù)組中，阿托伐他汀鈣片單用和聯(lián)合艾塞那肽大劑量組的ICAM-1表達水平、阿托伐他汀鈣片聯(lián)合艾塞那肽大劑量組的VCAM-1表達水平均較普通飲食組低，表明阿托伐他汀鈣片聯(lián)合大劑量艾塞那肽抑制黏附分子表達的效果較好，為防治糖尿病合并大血管并發(fā)癥提供了依據(jù)。艾塞那肽小劑量組中VCAM-1、ICAM-1的表達水平均較其余組高，考慮與該組單獨用藥及用藥劑量較小有關(guān)。本實驗結(jié)果與Arakawa等[11]的結(jié)論一致，證實GLP-1可抑制AS的進程。

目前普遍認(rèn)為，GLP-1的心血管保護效應(yīng)是綜合作用的結(jié)果，它可以通過改善心血管系統(tǒng)的相關(guān)危險因素如降糖、調(diào)脂等而發(fā)揮保護作用[12]。本實驗血清血脂(TC、TG、LDL-C)水平降低提示艾塞那肽可在一定程度上改善脂代謝。由于本實驗采用的ApoE-/-小鼠是非糖尿病鼠，因此在降糖及減輕胰島素抵抗上的作用表現(xiàn)并不明顯。

綜上所述，艾塞那肽可能通過抑制ApoE-/-小鼠主動脈上VCAM-1、ICAM-1等多種細(xì)胞因子的過度表達實現(xiàn)其抗AS作用，從而抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊的形成。同時，艾塞那肽還可通過改善相關(guān)危險因素發(fā)揮對心血管系統(tǒng)的綜合保護作用。因此我們認(rèn)為，糖尿病大血管病變患者應(yīng)用GLP-1類藥物不僅可以降糖，一定程度上還可對大血管病變起到改善和延緩作用，是治療伴有大血管并發(fā)癥或合并血脂等代謝異常糖尿病患者的理想藥物。

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Effects of exenatide on expression of VCAM-1, ICAM-1 in ApoE-knock-out mice with atherosclerosis

CHEN Ruo-ran1, LIANG Lin-lang2*, WANG Jian-mei2, WANG Yu2
1Postgraduate Training Base of General Hospital of Shenyang Command, Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121000, China
2Department of Endocrinology, General Hospital of Shenyang Command, Shenyang 110016, China
*

, E-mail: lianglllj@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of exenatide, a glucagon-like peptide-1 receptor agonist, on aortic lesions in ApoE-knock-out (ApoE-/-) mice with atherosclerosis.MethodsApoE-/-mice were randomly divided into normal diet group (n=14) and high-fat diet group (n=68). After fed for 12 weeks, 4 from normal diet group and 8 from high-fat diet group were randomly chosen for verification of model reproductions. Then the mice in high-fat diet group were divided into 6 groups (10 each): nondrug intervention group, atorvastatin group, exenatide low/high-dose groups and atorvastatin + exenatide low/high-dose groups. After 6 weeks of drug intervention, blood samples were collected from the retro-orbital venous plexus of the mice. All the mice were sacrificed by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital, and paraffin sections of the aortic arch was processed for HE staining. The serum lipid level was measured by ELISA, the protein expressions of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) were determined by Western blotting.ResultsHE staining showed that the histology of the aorta of mice in normal diet group and atorvastatin + exenatide high-dose group were normal, but those of atorvastatin group and exenatide low/high-dose groups and atorvastatin + exenatide low-dose group showed extensive pathological thickening of endometrium. Lipid plaques were formed with visible lipid cores in the aorta of mice in non-drug intervention group. Application of exenatide alone or combined with atorvastatin reduced the levels of serum lipid (TC, TG, LDL-C) in varying degrees (P＜0.05). Different doses of exenatide alone or in combination with atorvastatin reduced the expression of VCAM-1, ICAM-1 in aorta (P＜0.05).ConclusionsExenatide may inhibit the formation of atherosclerotic lesions by down-regulating the expression of VCAM-1, ICAM-1 in aorta of ApoE-/-mice.

R541.4

A

0577-7402(2013)06-0467-05

2013-03-04；

2013-04-15)

(責(zé)任編輯：張小利)

陳若然，碩士研究生。主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的研究

121000 遼寧錦州 遼寧醫(yī)學(xué)院沈陽軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地(陳若然)；110016 沈陽 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科(梁琳瑯、王健美、王宇)

梁琳瑯，E-mail：lianglllj@sina.com