李元城，張衛(wèi)國，秦建華，林炳承

微流控芯片上胰島素樣生長因子1和堿性成纖維細胞生長因子對兔關節(jié)軟骨細胞增殖的影響

李元城，張衛(wèi)國，秦建華，林炳承

目的在微流控芯片平臺上探索三維培養(yǎng)環(huán)境下胰島素樣生長因子1(IGF-1)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對軟骨細胞體外增殖的影響。方法微流控芯片上，分別在IGF-1、bFGF以及二者組合濃度梯度下三維培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞，2周后計算軟骨細胞增殖率并與傳統(tǒng)的96孔板培養(yǎng)結果進行比較。結果IGF-1在57.14ng/ml產生最大增殖效應，平均倍增2.38倍；bFGF在5.72ng/ml產生最大增殖效應，平均倍增3.85倍；85.71ng/ml IGF-1+1.43ng/ml bFGF的組合可使軟骨細胞產生最大的增殖效應，平均倍增4.76倍。微流控芯片與96孔板傳統(tǒng)培養(yǎng)的軟骨細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義。結論一定濃度組合的IGF-1和bFGF可協(xié)同產生最大的增殖效應；微流控芯片技術可用于軟骨組織工程領域，具有廣闊的應用前景。

軟骨細胞；組織工程； 微流控芯片；胰島素樣生長因子1；成纖維細胞生長因子2

關節(jié)軟骨是一種無血管組織，其結構特點決定了軟骨一旦受損便很難自我修復。自體軟骨細胞移植技術(autologous cartilage transplant，ACT)首次將組織工程學方法應用到骨科領域，其基本過程為通過關節(jié)鏡手術收集非負重區(qū)軟骨組織，體外培養(yǎng)擴增后，再通過手術將軟骨細胞回植到軟骨缺損處[1-2]。但從患者體內得到的軟骨細胞數量有限，且體外擴增時存在軟骨細胞表型丟失的現(xiàn)象，從而限制了自體軟骨細胞移植在臨床上的應用[3]。其中細胞表型丟失考慮與傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法采用靜態(tài)的、宏觀的培養(yǎng)環(huán)境與體內差別過大有關。近年來出現(xiàn)的微流控芯片技術為細胞培養(yǎng)提供了新的方法學支持，它可以模擬人體的微循環(huán)系統(tǒng)，持續(xù)地提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質、氧氣等，同時排出細胞代謝產物[4-5]。微流控芯片還可以使多種功能單元在整體可控的微小平臺上靈活組合、規(guī)模集成，這種集成可以將各種干預因素納入研究，從而更好地控制細胞行為。本研究在微流控芯片平臺上探索三維培養(yǎng)環(huán)境下胰島素樣生長因子1(IGF-1)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對軟骨細胞體外增殖的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1主要材料 健康雄性新西蘭大白兔1只，由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號SYXK(遼)2008-0002。高糖DMEM、胰蛋白酶購自Hyclone公司；標準胎牛血清購自天津TBD公司；IGF-1、bFGF購自美國Peprotech公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；Ⅰ型膠原凝膠購自美國R&D公司；異硫氰酸熒光素標記的右旋糖苷(FITCDextran)購自美國Sigma-Aldrich公司；聚二甲基硅氧烷(PDMS)購自Dow Corning公司。

1.2方法

1.2.1芯片的設計與操作 芯片設計如圖1所示，主要由兩部分組成：濃度梯度生成器(concentration gradient generator，CGG)和細胞培養(yǎng)單元。CGG的設計原理基于Jeon等[6]的研究。本實驗芯片通道的直徑為100μm，液體泵入速度為0.1μl/min，流體在微通道中均呈層流特征。通過彎曲的設計使微通道內的多項層流通過流體剪切力混合。流體在微通道網絡中分配、混合，即可生成基于多項層流的濃度梯度(圖1A、B)。CGG的每個出口連接兩個平行的流出通道。在平行的通道之間并聯(lián)有3個細胞培養(yǎng)微室(每個微室長700μm，寬500μm，高100μm)。每個培養(yǎng)微室連有一個細胞注入口以及細胞注入通道，用于軟骨細胞-Ⅰ型膠原混合體的接種。細胞培養(yǎng)微室兩側平行通道內的培養(yǎng)基通過滲透作用進入膠體營養(yǎng)細胞，同時細胞代謝產物通過擴散作用進入兩側通道被排出。另外，由于兩側通道內的細胞因子濃度相同，當它們滲透進入膠體達到飽和后，膠體內細胞因子濃度與兩側通道內細胞因子的濃度相同(圖1C)。

圖1 微流控芯片設計Fig. 1 Microfluidic device design

微流控芯片是運用快速成型[7]與軟光刻技術[8]由上層的PDMS與底層的玻璃基片構成。外接的兩個微泵分別驅動空白培養(yǎng)基和生長因子培養(yǎng)基(濃度為c)通過兩個入口注入CGG時，兩股液體在通道網絡中反復混合、分離、稀釋，根據公式計算在CGG的8個出口處，溶液的濃度依次為0、1/7c、2/7c、3/7c、4/7c、5/7c、6/7c和c[9]。每種濃度的液體在相應的兩個平行通道中流出并滲透至細胞培養(yǎng)微室中。將芯片放置于37℃、5%CO2孵箱內進行細胞培養(yǎng)，液流速度控制為0.1μl/min。

1.2.2濃度梯度生成器性能考察 IGF-1和bFGF均為大分子物質(分子量分別為7649Da、18 000Da)。為了驗證大分子物質在芯片上的濃度梯度生成情況，采用與其分子量相近的FITC-Dextran(分子量20 000Da)進行驗證實驗。從兩個入口以0.1μl/min等速灌注普通培養(yǎng)基和FITC-Dextran染料，熒光染料在CGG中不斷被稀釋。檢測CGG 8個出口處的熒光強度并與理論值進行比較，確定濃度梯度生成的有效性和準確性。

1.2.3軟骨細胞培養(yǎng) 自耳緣靜脈注射空氣處死動物，無菌條件下取雙側肱骨頭與股骨頭。用手術刀片切取關節(jié)表面軟骨并剪成1mm×1mm×1mm團塊，雙抗溶液浸泡30min，吸棄上清液；胰蛋白酶和0.25%Ⅱ型膠原酶消化4h，1000r/min離心10min，棄上清，PBS緩沖液重懸沉淀；200目銅網過濾，再次1000r/min離心10min，棄上清；采用完全培養(yǎng)基重懸沉淀，以5×105/ml密度接種于6cm培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.4細胞活性及FITC-Dextran在凝膠中的擴散三維環(huán)境下培養(yǎng)軟骨細胞(即把細胞包埋在凝膠中培養(yǎng))2周，觀察細胞形態(tài)以及活性(羅丹明123、碘化丙啶染色)以確定在芯片上培養(yǎng)的可行性。在芯片培養(yǎng)微室內注入Ⅰ型膠原凝膠，然后從上游的兩個入口灌入熒光染料(FITC-Dextran)，觀察其在凝膠中的擴散情況。

1.2.5細胞接種、干預及檢測 4℃下將第二代軟骨細胞以1×105/ml溶于0.24%Ⅰ型膠原凝膠中并接種于芯片培養(yǎng)微室內(每個微室注入細胞凝膠混合物約0.4μl)，37℃孵育1h使膠體凝固。將100ng/ml IGF-1無血清培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基、10ng/ml bFGF無血清培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基、100ng/ml IGF-1無血清培養(yǎng)基和10ng/ml bFGF無血清培養(yǎng)基分別注入到3個芯片中，待穩(wěn)定產生濃度梯度后計時2周。由于PDMS材料和玻璃基片透明，2周后可以直接在倒置相差顯微鏡下計數芯片上的軟骨細胞數量，計算細胞增殖率。將同批次軟骨細胞以相同條件接種于傳統(tǒng)的96孔板中培養(yǎng)2周(每孔100μl，每組3個孔)，每3d換液1次，2周后利用0.25%膠原酶溶解96孔板中的膠原凝膠，收集懸液并在細胞計數板上計數細胞數量，計算細胞增殖率。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素多變量χ2檢驗，進一步兩兩比較采用LSD Post-hoc檢驗。微流控芯片與傳統(tǒng)的96孔板培養(yǎng)的細胞增殖率比較采用兩樣本均數t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1濃度梯度生成器的性能考察 在芯片分支處，普通培養(yǎng)基與熒光染料起初保持層流狀態(tài)，但進入彎曲的通道后，兩種液體通過剪切力不斷混合直至均勻。CGG的8個出口中，從出口1到出口8熒光強度逐漸增強。CGG 8個出口的熒光強度與理論值比較，相關系數r=0.9953(圖2)。

2.2細胞形態(tài)及活性檢測結果 細胞培養(yǎng)平板中二維培養(yǎng)軟骨細胞，36h后細胞伸出偽足呈多角形(圖3A)。芯片培養(yǎng)微室內，三維培養(yǎng)軟骨細胞36h后細胞呈球形(圖3B)，與軟骨細胞在體內的存在方式相同[10]。芯片上三維培養(yǎng)軟骨細胞2周后，采用羅丹明123和碘化丙碇測定細胞活性，羅丹明采用488nm激光激發(fā)，碘化丙啶采用543nm激光激發(fā)，2min后共聚焦顯微鏡下觀察紅綠兩色熒光并拍照。每個細胞微室接種的軟骨細胞數量為100個左右，其中碘化丙啶紅染的死亡細胞只有1～2個，表明芯片上三維培養(yǎng)的軟骨細胞活性≥95%(圖3C)。

圖2 CGG性能考察Fig. 2 CGG performance validation

2.3FITC-Dextran在Ⅰ型膠原凝膠中的滲透情況FITC-Dextran隨著時間推移通過滲透進入凝膠，凝膠中的熒光強度隨之增強直至平衡。

2.4三維環(huán)境下IGF-1、bFGF以及二者組合作用下軟骨細胞的增殖情況 膠原凝膠中的軟骨細胞在生長因子作用下，2周后仍保持球形外觀。在0～57.14ng/ml范圍內，IGF-1可促進軟骨細胞增殖且呈劑量相關性，并于57.14ng/ml達到最大效應(平均倍增2.38倍)。IGF-1在57.14～100ng/ml范圍內各組增殖率無明顯差異(P＞0.05)。在0～5.72ng/ ml范圍內，bFGF可促進軟骨細胞增殖且呈劑量相關性，并于5.72ng/ml達到最大效應(平均倍增3.85倍)；隨著bFGF濃度繼續(xù)增加，細胞增殖率呈下降趨勢。IGF-1和bFGF組合的8個濃度(ng/ml)依次為0/10、14.28/8.58、28.57/7.15、42.86/5.72、51.15/4.29、71.43/2.86、85.71/1.43、100/0，其中85.71ng/ml IGF-1+1.43ng/ml bFGF的組合可使軟骨細胞產生最大的增殖效應(平均倍增4.76倍)，與其他各組合比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖4)。微流控芯片與96孔板培養(yǎng)的軟骨細胞增殖率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討 論

微流控芯片技術又稱微流控芯片實驗室(labon-a-chip)，指的是在一塊幾平方厘米的芯片上構建的化學或生物實驗室。它把化學和生物等領域中涉及的樣品制備、反應、分離、檢測、細胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成到一塊很小的芯片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以實現(xiàn)常規(guī)化學或生物實驗室的各種功能。

本次實驗中應用濃度梯度生成器可以準確快捷地在30s內將生長因子稀釋成8個濃度，并且可以通過改變生長因子的種類和濃度輕易改變實驗條件。另外芯片上集成的24個培養(yǎng)微室實現(xiàn)了軟骨細胞的自動化培養(yǎng)。實驗表明軟骨細胞在芯片上具有良好的適應性，2周后細胞存活率≥95%。PDMS材料用于細胞培養(yǎng)的可行性已得到廣泛證實[11-12]，其主要特點為生物相容性好、無毒、高氧氣通透率及視覺透明性。

傳統(tǒng)實驗中，細胞處于一種靜止的培養(yǎng)環(huán)境中，培養(yǎng)基的更換是通過人工定期排除然后加入新鮮培養(yǎng)基。這種方式不僅增加了污染機會，而且造成了一種不穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。在以灌注-擴散為基礎的微流控培養(yǎng)體系中，當培養(yǎng)基流經兩個平行通道時，生長因子等營養(yǎng)物質可持續(xù)地滲透到膠體中，同時細胞代謝產物通過滲透被排出。這樣的設計充分模擬了體內的物質能量交換方式，不但減少了人工操作及潛在的污染，且為細胞提供了一個持續(xù)穩(wěn)定的環(huán)境。

圖4 微流控芯片IGF-1、bFGF以及二者組合作用下的軟骨細胞增殖情況Fig. 4 Chondrocyte proliferation presented in IGF-1, bFGF and their combinations

微流控芯片操作簡便、省時省力，明顯降低了耗材試劑的成本。本次實驗中，培養(yǎng)基的消耗小于5ml，IGF-1和bFGF的消耗小于200ng。在軟骨細胞自體移植時，由于不同個體、年齡、疾病以及不同層面上軟骨細胞的體外培養(yǎng)條件是特異的，大量提取軟骨細胞來摸索其最佳培養(yǎng)條件不現(xiàn)實，而微流控芯片技術對細胞數量要求極少(1～100個)，可平行進行多種實驗，因此在自體軟骨細胞移植領域具有獨特的優(yōu)勢。

在自體軟骨細胞移植中，我們可以根據需要設計更為精密的微流控芯片，將多種生長因子、三維環(huán)境以及生物力學刺激高度集成，并利用有限的軟骨細胞摸索出“菜單”式的培養(yǎng)方案。這種方案完全是個性化的，能滿足不同來源軟骨細胞的要求且提高了種子細胞的質量，使軟骨組織工程產業(yè)化成為可能。

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Effects of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and basic fibroblast growth factor (bFGF) on the proliferation of rabbit articular chondrocytes embedded in microfluidic chip

LI Yuan-cheng1, ZHANG Wei-guo1*, QIN Jian-hua2, LIN Bing-cheng2
1Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian, Liaoning 116001, China
2Department of Biotechnology, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian, Liaoning 116001, China
*

, E-mail: zhxiao_2004@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the effects of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and basic fibroblast growth factor (bFGF) on the proliferation of chondrocytes in a 3-dimensional (3D) culture environment of microfluidic chip. Method Rabbit articular chondrocytes embedded in microfluidic chip and 96-well plate were cultured with solitary and component concentrations of IGF-1 and bFGF for 2 weeks, and then the proliferation rates of chondrocytes were calculated and compared. Results The maximal proliferation effect of IGF-1 was found when the concentration reached 57.14ng/ml (up to 2.38-fold), and of bFGF at the concentration of 5.72ng/ml (up to 3.85-fold), while the maximal proliferation effect of combination of IGF-1+bFGF was found at the concentration of 85.71ng/ml IGF-1 plus 1.43ng/ml bFGF (up to 4.76-fold). There was no significant difference between the proliferation rate of chondrocytes cultured in microfluidic chip and 96-well plate. Conclusions A combination of IGF-1 plus bFGF in certain concentration may synergistically increase the proliferation of chondrocytes. Microfluidic chip could be used for efficient cartilage tissue engineering.

chondrocytes; tissue engineering; microfluidic chip; insulin-like growth factor i; fibroblast growth factor 2

R394.26

A

0577-7402(2013)06-0476-05

2013-01-14；

2013-05-08)

(責任編輯：胡全兵)

李元城，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師。主要從事骨與關節(jié)損傷方面的基礎與臨床研究

116001 遼寧大連 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科(李元城、張衛(wèi)國)；116001 遼寧大連 中國科學院大連化學物理研究所(秦建華、林炳承)

張衛(wèi)國，E-mail：zhxiao_2004@yahoo.com.cn