趙春霞，盛勃，唐德江，李鵬，趙和生，楊煥民，劉勝軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

線粒體是真核細(xì)胞中普遍存在的一種重要而獨(dú)特的細(xì)胞器，線粒體DNA 已被廣泛應(yīng)用于生物的發(fā)病機(jī)理、遺傳變異、生物進(jìn)化等多方面的研究，并取得了許多有價(jià)值的結(jié)果。動(dòng)物線粒體DNA 具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、只有16 Kb 左右[1-3]、母性遺傳和進(jìn)化速度快，個(gè)體內(nèi)有高度的均一性，無組織特異性[4]，便于取材分析。同時(shí)，mtDNA 又具有廣泛的種內(nèi)和種間多態(tài)性，在親緣關(guān)系相近的物種間其進(jìn)化速度比核基因快。開展動(dòng)物線粒體DNA 結(jié)構(gòu)與功能的研究，對于深入了解生物體發(fā)育過程中基因表達(dá)與調(diào)控的分子機(jī)理，核質(zhì)相互作用方式以及分析生物種間，種內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系等都具有重要意義[5-7]。如何快速有效地提取mtDNA 無疑成了進(jìn)行這些方面研究的前提。應(yīng)用了堿變性法，對如何快速高效地提取mtDNA 進(jìn)行了探討。

1 材料和方法

1.1 材料

以新鮮鯉魚的肝臟、脾臟和腎臟組織為材料，材料購自大慶市水產(chǎn)品市場。

1.2 方法

取5～16 g 鯉魚肝臟組織于少量SE 液中剪碎（或研磨碎），加約30 mL SE，以手動(dòng)勻漿器上下勻漿10 次。將勻漿物1 100 r·min-1離心10 min 取上清液，以1 200 r·min-1離心12 min，沉淀即為線粒體，加5 mLSE 液懸浮線粒體，然后轉(zhuǎn)至1.5 mL Eppendorf 管，每管1 mL 。每管加入1 mg·mL-1DNase1 1.5 uL 及RNaseA 2 uL，混勻，室溫下靜置70 min 后，在每管中加入70 uL 0.50 moL·L-1EDTA（pH8.0），1 200 r·min-1離心5 min，取沉淀，加入750 uL STE 洗滌沉淀。離心去上清，沉淀每管中加入220 uL 蛋白酶K，溫浴2.5 h。1 500 r·min-1離心10 min，棄上清液，每管加150 mL TEN 溶液，混勻冰浴10 min，1 500 r·min-1離心10 min 取上清液，加入半倍體積的Tris-酚，室溫振蕩15 min 后以1 500 r·min-1離心10 min，小心吸取上層水相，去除殘留的蛋白，重復(fù)此步驟2～3 次，直至中間白色的蛋白層基本沒有，加入與原上清液1/2 體積的氯仿—異戊醇（23∶1），充分混勻。1 200 r·min-1離心10 min 取水相，加等體積異丙醇或無水乙醇混勻1 200 r·min-1離心12 min 取沉淀，用70%冷乙醇洗滌，1 200 r·min-1離心5 min 真空或自然干燥。加適量體積TE 溶解。

2 結(jié)果與分析

將提取的線粒體DNA 在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，以檢測其純度和相對分子質(zhì)暈。瓊脂糖凝膠濃度為0.1 ug·mL-1緩沖體系為TE 電泳液，在室溫以5 V·cm-1恒壓電泳當(dāng)溴酚藍(lán)行至離前端1.5 cm 時(shí)停止電泳后用清水沖洗，用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察，電泳條帶為清晰、整齊、均勻的一條帶，背景清晰。其中樣本1 的拖尾較小，條帶最為清晰，見圖1。

圖1 分離所得線粒體DNA 的電泳圖譜Fig.1 The gel electrophoresis map of mitochondrial DNA

3 討論

用本法提取出的魚組織線粒體基因組結(jié)構(gòu)完整，減少了分析的誤差。本方法是在前人工作的基礎(chǔ)上作了大量的試驗(yàn)而總結(jié)出來的，主要注意的幾個(gè)問題如下：

3.1 勻漿器的勻漿次數(shù)是關(guān)鍵之一，勻漿次數(shù)過少時(shí)線粒體游離的量少，影響提取量；而勻漿次數(shù)過多時(shí)核膜破裂，增加了核DNA 污染。為了弄清楚上下勻漿的次數(shù)，可先勻漿5～6 次，取樣；再勻漿5～6 次，取樣；依次增加勻漿次數(shù)再分別取樣。采用疏松的手動(dòng)勻漿器勻漿，上下10 次即可，以免破壞細(xì)胞核，避免核DNA 的干擾。

3.2 差速離心是提取線粒體的關(guān)鍵。在提取魚線粒體時(shí)，去除細(xì)胞碎片及雜質(zhì)的離心力為1 000～1 500 r·min-1離心時(shí)間10～15 min；沉淀線粒體的離心力為1 200～1 500 r·min-1。離心力在1 200～3 500 r·min-1時(shí)隨離心速度增加，沉淀內(nèi)線粒體比例不斷上升。

3.3 使用的Tris 酚的pH 值應(yīng)在8.0，DNA 在pH 為7.8～8.0 的條件下比較穩(wěn)定，在中性或酸性條件下，RNA 比DNA 更容易游離到水相，可獲得RNA 含量較少的DNA 樣品。

3.4 溶液的配制上適當(dāng)提高了裂解液的濃度及pH值，加強(qiáng)脂類的洗滌效果，增強(qiáng)線粒體膜的裂解，對獲得純度較高的mtDNA 具有很好的效果。同時(shí)適當(dāng)降低Tris-HCl 的濃度。增強(qiáng)低滲效果，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性。

3.5 在提取線粒體DNA 的離心溫度上，保證在4 ℃進(jìn)行防止DNA 由于離心的溫度升高而發(fā)生變性或斷裂，影響其完整性。提高了后續(xù)研究酶切結(jié)果的準(zhǔn)確性及真實(shí)性。

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