張曜武，馮雪

（青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042）

松科植物紅松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc）松塔中含有萜類及多糖等多種重要天然成分［1］，藥理研究結(jié)果顯示松塔多糖具有調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、抑制腫瘤以及抗氧化、抗菌等諸多功效［2］，具有良好的應(yīng)用前景。

與水提醇沉法等多糖制備的傳統(tǒng)方法相比，膜分離制備技術(shù)具有許多明顯優(yōu)勢(shì)［3］，本研究中嘗試將膜分離技術(shù)用于紅松松塔多糖制備，文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)有同類工作報(bào)道。實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)考察了微濾過(guò)程中料液溫度、操作壓力和料液濃度等對(duì)膜通量的影響，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳微濾條件；由于多糖的不同分子量組分常呈現(xiàn)不同活性［4］，因此本實(shí)驗(yàn)中還采用了不同截留分子量的超濾膜對(duì)紅松松塔多糖進(jìn)行分級(jí)制備，獲得了不同分子量的紅松松塔多糖，及其分子量分布的大致規(guī)律，以期為后續(xù)活性研究和工業(yè)化開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

紅松松塔（產(chǎn)地：東北地區(qū)）、酚酞指示液、氫氧化鈉、硫酸、苯酚、亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、3，5－二硝基水楊酸、鹽酸（以上試劑均為分析純）。

1.2 儀器

FA1004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），SHZ－III式循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠），TGT－16C型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），LD－800粉碎機(jī)（長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠），電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），0.2μm中空纖維微濾膜（天津膜天膜科技股份有限公司），截留分子量分別為6kDa、10kDa、50 kDa、100kDa的中空纖維超濾膜（天津膜天膜科技股份有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 紅松松塔多糖含量的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用DNS比色法進(jìn)行紅松松塔多糖含量測(cè)定。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取105℃恒重過(guò)的葡萄糖50mg，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，稀釋，搖勻，定容，即得葡萄糖對(duì)照品溶液（0.5mg／mL）。精密量取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1mL 的 葡 萄 糖對(duì)照品溶液放入10mL具塞試管中，加水使成2mL，分別精密加入DNS顯色液2.5mL混勻，在沸水浴中加熱7min，取出，立即用流冷卻至室溫，加水3mL搖勻，用相應(yīng)試劑做空白，在490nm測(cè)吸光度。以葡萄糖濃度（mg／mL）為橫坐標(biāo)（濃度0.0000～0.06667mg／mL），以吸光度為縱坐標(biāo)繪制490nm標(biāo)準(zhǔn)曲線、得出回歸方程標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。滴，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容即得。

圖1 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）單糖溶液的制備。精密量取經(jīng)過(guò)超濾處理的截留液5mL，置于10mL容量瓶中，加酚酞指示液1滴，搖勻，用1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色，稀釋、定容即得。

（3）含量測(cè)定。取總糖溶液、單糖溶液各2mL，分別精密加入DNS顯色液2.5mL混勻，在沸水浴中加熱7min后，立即用流水冷卻至室溫，加水3mL搖勻，用相應(yīng)的試劑做空白，在490nm測(cè)吸收度A。多糖含量計(jì)算公式如下：

式中：n1、n2分別為各自的稀釋倍數(shù)。

2.2 紅松松塔多糖微濾制備工藝研究

紅松松塔多糖制備工藝見(jiàn)圖2。首先經(jīng)過(guò)濾等預(yù)處理步驟除去提取液中塵埃、粗纖維等雜質(zhì)，隨后微濾除去膠質(zhì)等大分子物質(zhì)，得到含紅松松塔多糖的微濾滲出液，再經(jīng)超濾除去其中的小分子物質(zhì)，所得截留液即為濃縮的多糖提取液。膜分離過(guò)程中，按照公式J＝V／（S·t）計(jì)算膜通量，其中t為膜分離時(shí)間，h；J為膜通量，L／m2·h；V為t時(shí)間內(nèi)透過(guò)液的體積，L；S為有效膜面積，m2。

圖2 紅松松塔多糖制備工藝路線

2.2.1 影響微濾效果的主要因素考察

（1）料液濃度對(duì)膜通量的影響。在0.08MPa、常溫條件下，將不同濃度的紅松松塔提取液進(jìn)行微濾處理，料液濃度對(duì)膜通量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液濃度對(duì)膜通量的影響

2.1.2 紅松松塔多糖樣品含量測(cè)定

（1）總糖溶液的制備。取經(jīng)過(guò)超濾處理的截留液2.5mL，加水2.5mL、6mol／L鹽酸溶液15mL，在沸水浴中加熱30min，用流水冷卻后加酚酞指示液1

由圖3可知，隨著初始料液濃度的增大，膜通量減小。這是因?yàn)殡S著初始料液濃度的增大，料液粘度增大，導(dǎo)致濃差極化嚴(yán)重；此外，初始料液濃度增大，溶質(zhì)吸附在膜表面，阻塞膜孔，造成通量下降。

（2）操作壓力對(duì)膜通量的影響。常溫下對(duì)20g／L的紅松松塔多糖提取液進(jìn)行微濾，壓力對(duì)膜通量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 壓力對(duì)膜通量的影響

由圖4可知，隨著壓力的增大，膜通量顯著增大。這是因?yàn)閴毫υ龃笫沟萌芤和ㄟ^(guò)濾膜的推動(dòng)力增大。壓力繼續(xù)增大，濃差極化嚴(yán)重，使有效的傳質(zhì)推動(dòng)力下降導(dǎo)致膜通量增長(zhǎng)變緩。

（3）料液溫度對(duì)膜通量的影響。在0.08MPa，對(duì)20g／L的紅松松塔提取液進(jìn)行微濾，料液溫度對(duì)膜通量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 料液溫度對(duì)膜通量的影響

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，膜通量隨溫度的升高而呈上升趨勢(shì)。這是因?yàn)樯邷囟瓤墒谷芤赫扯认陆?、擴(kuò)散系數(shù)增大，而濃差極化減小，故膜通量增大。當(dāng)溫度升高到一定程度后，膜通量增加趨勢(shì)趨于平緩，且溫度過(guò)高還會(huì)導(dǎo)致濾膜性能和溶液理化性質(zhì)的改變。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選微濾工藝

采用正交實(shí)驗(yàn)考察料液溫度t、操作壓力MPa、料液濃度C 3個(gè)因素對(duì)膜通量的影響，每個(gè)因素取3個(gè)水平，因素水平見(jiàn)表1。本研究選擇L9（34）表，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 微濾因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，微濾最佳條件為A3B1C3，即料液溫度40℃、料液濃度25g／L、操作壓力0.10MPa。由極差可以得出結(jié)論：影響微濾膜通量的主要因素中，操作壓力對(duì)膜通量的影響最大，其次為料液濃度，料液溫度對(duì)膜通量影響最小。

2.2.3 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按工藝條件A3B1C3進(jìn)行3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 微濾過(guò)程膜通量變化曲線

由圖6可知，該三組實(shí)驗(yàn)中膜通量理想，只有小幅度下降，說(shuō)明該優(yōu)化方案合理、可行。

2.3 紅松松塔多糖超濾制備方法及其分子量分布研究

2.3.1 紅松松塔總多糖的制備

將微濾滲出液經(jīng)截留分子量為6kDa的超濾膜進(jìn)行分離，所得濃縮液經(jīng)減壓蒸發(fā)得到總多糖固形物，測(cè)定其中總多糖含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 超濾前后總多糖含量對(duì)比

由表3可知，超濾純化后的樣品中多糖含量提高了約4倍，純化效果明顯。

2.3.2 不同分子量紅松松塔多糖的制備

在0.10MPa、常溫條件下選用截留分子量分別為100kDa、50kDa、10kDa、6kDa的超濾膜對(duì)上述微濾透過(guò)液依次進(jìn)行超濾分離，得到分子量＞10萬(wàn)、5萬(wàn)～10萬(wàn)、1萬(wàn)～5萬(wàn)、6000～1萬(wàn)等4段不同組分，測(cè)定各段的多糖含量，得出紅松松塔多糖分子量分布結(jié)果，見(jiàn)圖7。

圖7 紅松多糖分子量分布

由圖7可知，分子量＞10萬(wàn)的組分占紅松松塔總多糖的9.5%，5萬(wàn)～10萬(wàn)之間的占70.2%，1萬(wàn)～5萬(wàn)之間的占3.2%，6000～1萬(wàn)的占17.1%。

3 結(jié)論

以上實(shí)結(jié)果表明，微濾過(guò)程的適宜操作條件為：料液濃度25g／L、操作壓力0.10MPa、料液溫度40℃，其中影響膜通量的主要因素為操作壓力，其次是料液濃度和溫度。微濾滲出液再經(jīng)截留分子量為6kDa的超濾膜純化后，多糖含量可由7.20%，提高到35.16%，純化效果顯著。

本實(shí)驗(yàn)中還測(cè)得紅松松塔多糖分子量分布如下：分子量＞10萬(wàn)的占9.5%，5萬(wàn)～10萬(wàn)之間的占70.2%，1萬(wàn)～5萬(wàn)之間的占3.2%，6000～1萬(wàn)的占17.1%，這些不同分子量的各組分樣品正在進(jìn)行后續(xù)活性研究。

［1］Sakagami H，Takeda K，MakinoY，et al.Partial purification of novel differentiation－inducing substances（s）from hot water extract of Japanese pine cone［J］.Jep.J.Cancer Res，1986，77（1）：59－61.

［2］王智航，張永紅，于婉婷，等.紅松松塔、松子殼研究進(jìn)展及在畜牧業(yè)中應(yīng)用可行性分析［J］.國(guó)外畜牧學(xué)——豬與禽，2009，29（4）：88－89.

［3］葉曉，俞軍，易劍平，等.利用膜法分離姬松茸多糖的研究［J］.食品科技，2006（2）：44－46.

［4］Misaki A，Kishida E，Kakuta M，et al.Carbohydrate and Carbohydrate Polymers［M］.ATL Press.Mount Prospect，Illinois USA，1993：116－129.