羅偉,高澤霞,曾聰,鄧偉,易少奎,錢雪橋,王衛(wèi)民

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢430070; 2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司,廣東廣州511400)

團(tuán)頭魴微衛(wèi)星多重PCR體系的建立及應(yīng)用

羅偉1,高澤霞1,曾聰1,鄧偉1,易少奎1,錢雪橋2,王衛(wèi)民1

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢430070; 2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司,廣東廣州511400)

利用團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記組合建立了6個(gè)微衛(wèi)星多重PCR體系,包括2個(gè)四重PCR和4個(gè)三重PCR體系。利用構(gòu)建的6個(gè)微衛(wèi)星多重PCR體系評(píng)估了團(tuán)頭魴淤泥湖群體的遺傳多樣性,結(jié)果表明,平均等位基因數(shù)為5.8,平均期望雜合度和平均觀測(cè)雜合度分別為0.72和0.77,平均多態(tài)性信息含量為0.601,20個(gè)位點(diǎn)中有9個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡 (P＜0.05)。本研究中篩選出的多重PCR組合為團(tuán)頭魴的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和親子鑒定等研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

團(tuán)頭魴;微衛(wèi)星;多重PCR;遺傳多樣性

微衛(wèi)星DNA(microsatellite)由2～6個(gè)核苷酸為核心序列的串聯(lián)重復(fù)而成,其數(shù)量巨大,隨機(jī)分布于整個(gè)基因組。自 20世紀(jì) 80年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[1],微衛(wèi)星標(biāo)記以其分布廣泛、共顯性遺傳、多態(tài)性高等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于個(gè)體鑒定、群體遺傳學(xué),以及進(jìn)化和基因組作圖等領(lǐng)域[2-4]。目前,應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)動(dòng)植物進(jìn)行群體遺傳和親子鑒定等的研究,通常需要對(duì)多個(gè)群體大量個(gè)體的多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè),操作繁瑣、工作量大、試驗(yàn)成本高。1988年,Chamberlian等[5]首次提出在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)微衛(wèi)星引物,同時(shí)進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)序列的擴(kuò)增,即多重 PCR (multiplex PCR)。該技術(shù)可一次擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn),同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)的基因型鑒別,使基因分型變得簡(jiǎn)捷,提高了檢驗(yàn)效率,并且多重PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增兩條以上的靶基因片斷,出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率較常規(guī)PCR小得多,有效地減少了假陽(yáng)性現(xiàn)象。目前,多重PCR技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)物種的群體遺傳多樣性分析[6-7]、譜系分析[8-9]和 DNA檢測(cè)[10]中被廣泛應(yīng)用。在水產(chǎn)領(lǐng)域,對(duì)棕鱒[11]、大菱鲆[12]和中國(guó)明對(duì)蝦[13]等已建立了多重PCR體系。

團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala隸屬于鯉形目Cypriniformes、鯉科Cyprinidae、魴屬M(fèi)egalobra-ma,俗稱武昌魚(yú),是中國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)名貴魚(yú)類之一,原產(chǎn)于長(zhǎng)江中下游的通江湖泊,由于其生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)、味道優(yōu)美、營(yíng)養(yǎng)豐富,自20世紀(jì)60年代人工繁殖取得成功以來(lái),在中國(guó)各地得到廣泛推廣,目前團(tuán)頭魴已成為了中國(guó)最重要的池塘混養(yǎng)魚(yú)類之一。幾十年來(lái),由于原產(chǎn)地野生資源被過(guò)度捕撈以及各地廣泛移植和人工近親繁殖,團(tuán)頭魴的種質(zhì)資源不斷衰退和混雜[14]。為了保護(hù)團(tuán)頭魴野生種質(zhì)資源并獲得更好的良種,國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系——大宗淡水魚(yú)類產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心啟動(dòng)了 “團(tuán)頭魴種質(zhì)資源與育種”項(xiàng)目。為實(shí)現(xiàn)團(tuán)頭魴分子育種,目前已有不少有關(guān)其微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)的報(bào)道[15-18],但尚未見(jiàn)其多重PCR體系的開(kāi)發(fā)。本研究中,根據(jù)本課題組開(kāi)發(fā)的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記,作者優(yōu)化篩選了團(tuán)頭魴多重微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增體系,并用于評(píng)估了團(tuán)頭魴淤泥湖野生群體的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

2009年6月,采集團(tuán)頭魴湖北公安淤泥湖野生群體,隨機(jī)選取40尾,剪取鰭條,用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇固定,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 團(tuán)頭魴基因組DNA的提取 團(tuán)頭魴個(gè)體基因組DNA按照Tangs等[16]所用的蛋白酶K/SDS消化、苯酚-氯仿抽提法提取,將得到的DNA用雙蒸水稀釋成100 ng/μL,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 團(tuán)頭魴多態(tài)性微衛(wèi)星的準(zhǔn)備 本試驗(yàn)中選用的團(tuán)頭魴多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)發(fā)的團(tuán)頭魴EST-SSR標(biāo)記[19],基本信息見(jiàn)表1。

表1 用于多重PCR體系構(gòu)建的微衛(wèi)星位點(diǎn)的基本信息Tab.1 Information of the SSR loci for establishment ofmultiplex PCR system

1.2.3 團(tuán)頭魴微衛(wèi)星多重PCR體系的篩選和優(yōu)化

在單個(gè)微衛(wèi)星座位PCR的優(yōu)化條件基礎(chǔ)上,通過(guò)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)結(jié)合硝酸銀染色進(jìn)行多重PCR組合的篩選和優(yōu)化。步驟如下:

1)選取帶型清晰、雜帶少的微衛(wèi)星位點(diǎn);

2)利用 OLIGO 7軟件 (http://www.oligo. net)檢測(cè)不同位點(diǎn)的引物序列間是否存在較強(qiáng)的互補(bǔ),并選擇互補(bǔ)較低的引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增;

3)確認(rèn)多個(gè)位點(diǎn)的產(chǎn)物大小兩兩之間有明顯差異,一般大于20 bp;

4)挑選引物互不干擾、產(chǎn)物片段差異較大的引物篩選二重PCR;

5)在條帶清晰、效果良好的二重PCR體系中添加另一對(duì)引物篩選三重PCR體系;

6)按類似方法篩選四重PCR體系。

多重PCR擴(kuò)增體系為20μL,包括100 ng基因組 DNA,1×PCR緩沖液,1.5 mmol/L Mg2+,1 UTaq酶,0.2 mmol/L dNTPs,多重PCR擴(kuò)增體系內(nèi)各位點(diǎn)上、下游引物各為0.25μmol/L。PCR反應(yīng)條件為:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性45 s,退火45 s,72℃下延伸1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸7 min,于4℃下保存?zhèn)溆谩７磻?yīng)產(chǎn)物用于聚丙烯酰胺凝膠電泳分型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用PopGene 32軟件計(jì)算等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù) (Ne)、觀測(cè)雜合度 (Ho)、期望雜合度 (He),多態(tài)性信息含量 (PIC)。用Genepop on the web(http://genepop.curtin.edu.au/genepop_op1.html)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),其P值用PHWE表示。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建

設(shè)計(jì)的引物組合經(jīng)過(guò)篩選后共獲得了4個(gè)三重PCR和2個(gè)四重PCR體系,體系的引物組合、產(chǎn)物大小、退火溫度詳見(jiàn)表2。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 群體遺傳多樣性

團(tuán)頭魴淤泥湖野生群體的遺傳多樣性指數(shù)見(jiàn)表3。在野生群體中,平均等位基因?yàn)?.8,平均觀測(cè)雜合度和平均期望雜合度分別為0.77和0.72,平均多態(tài)性信息含量為0.601,20個(gè)位點(diǎn)中有3個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡 (P＜0.05),有6個(gè)位點(diǎn)極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡 (P＜0.01)。

表2 團(tuán)頭魴多重微衛(wèi)星PCR體系Tab.2 The systems of m icrosatellite multiplex PCR for bluntsnout black bream Megalobrama amblycephala

3 討論

微衛(wèi)星多重PCR是在同一PCR體系中同時(shí)用多個(gè)引物對(duì)同一模板進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)檢測(cè)多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型,可簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作步驟和節(jié)省試驗(yàn)材料,從而提高檢測(cè)效率[20]。在本試驗(yàn)中,僅用6個(gè)PCR反應(yīng)體系就完成了20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的分型,能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)團(tuán)頭魴群體的遺傳多樣性分析,充分體現(xiàn)了多重PCR操作簡(jiǎn)便、節(jié)省材料和高效性的特點(diǎn)。

為了確保多個(gè)目的片段在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)有特異性擴(kuò)增,微衛(wèi)星引物組合的選擇和PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化是關(guān)鍵。引物間的兼容性(復(fù)性溫度、引物二聚體)、引物濃度、PCR緩沖液的成分和濃度,以及PCR反應(yīng)體積和反應(yīng)程序等是影響多重PCR擴(kuò)增效率的主要因素。有學(xué)者認(rèn)為,引物間的兼容性和引物濃度比例是兩個(gè)核心因素[20-21];也有一些學(xué)者認(rèn)為,PCR緩沖液的成分影響多重PCR的擴(kuò)增效果,而反應(yīng)體積、循環(huán)次數(shù)對(duì)其擴(kuò)增效果影響較小[22]。本試驗(yàn)中,主要針對(duì)引物組合、退火溫度和反應(yīng)體積的大小進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),引物間的配對(duì)是最重要的影響因素,要選擇的引物間不能發(fā)生二聚體,濃度也不能過(guò)大,并且他們的最佳退火溫度要相近 (溫差≤5℃);此外,在同一個(gè)多重PCR反應(yīng)中存在多對(duì)引物間的競(jìng)爭(zhēng),多重PCR中各種化學(xué)成分 (Taq酶, dNTP、DNA模板)都應(yīng)高于單重PCR,同時(shí)還要降低復(fù)性溫度,并增加復(fù)性和延伸時(shí)間。

圖1 體系4-5(A)和3-7(B)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.1 The PAGE picture of 4-5(A)and 3-7(B)

表3 淤泥湖團(tuán)頭魴野生群體各SSR位點(diǎn)的信息Tab.3 Basic information of the SSR lociof bluntsnout black bream Megalobrama amblycephala population in Yuni Lake

生物群體的遺傳多樣性是生物多樣性的核心和本質(zhì),也是評(píng)估生物資源狀況的一個(gè)重要指標(biāo)。一個(gè)種群遺傳多樣性越豐富,其環(huán)境適應(yīng)能力就越強(qiáng),生存和進(jìn)化的潛力也就越大[23-24]。遺傳多樣性水平與生物的生長(zhǎng)速度、抗病能力等重要經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)[25]。一個(gè)種群的遺傳多樣性越豐富,從其中選出優(yōu)良品種的可能性就越高,其優(yōu)良性狀保持下去的潛力也就越大。本研究中采用20對(duì)Mam-EST標(biāo)記分析野生團(tuán)頭魴遺傳多樣性水平,發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性處于較低水平,該研究結(jié)果與其他學(xué)者的結(jié)果相似,張德春[26]運(yùn)用RAPD技術(shù)研究淤泥湖和梁子湖團(tuán)頭魴,認(rèn)為淤泥湖和梁子湖團(tuán)頭魴的遺傳多樣性均比較低;邊春媛等[27]用mtDNA控制區(qū)的RFLP研究了北方人工養(yǎng)殖的3個(gè)團(tuán)頭魴群體,只發(fā)現(xiàn)2種單倍型,據(jù)此也認(rèn)為其遺傳多樣性比較低,李弘華[28]使用mtDNA變異序列對(duì)梁子湖、鄱陽(yáng)湖和淤泥湖3個(gè)野生群體團(tuán)頭魴進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果在3個(gè)原產(chǎn)地的團(tuán)頭魴群體中僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)變異位點(diǎn)和5個(gè)單倍型,也認(rèn)為遺傳多樣性水平較低。與同屬的魚(yú)相比,李思發(fā)等[29]通過(guò)線粒體DNA控制區(qū)分析,團(tuán)頭魴的多態(tài)性低于三角魴和廣東魴。團(tuán)頭魴的遺傳多樣性水平較低主要是由于其生長(zhǎng)環(huán)境分布狹窄,僅限于長(zhǎng)江中下游的通江湖泊,棲息環(huán)境相似,生境多態(tài)性不高,以致團(tuán)頭魴進(jìn)化中遺傳分化不明顯。本研究中,在野生群體的20個(gè)位點(diǎn)中,有9個(gè)位點(diǎn)顯著偏離 Hardy-Weinberg平衡,這與李楊[30]的研究結(jié)果相符。該現(xiàn)象在多種水產(chǎn)動(dòng)物中出現(xiàn),如擬穴青蟹[31]、青蝦[32]、日本蟳[33]等,說(shuō)明群體中純合子個(gè)體所占的比例較大,普遍存在雜合子缺失現(xiàn)象,這可能是造成群體偏離 Hardy-Weinberg平衡的主要原因。作者認(rèn)為,造成多位點(diǎn)雜合子缺失的主要原因是由于近年來(lái)人為活動(dòng)的加劇,造成團(tuán)頭魴生境破碎,其繁殖受到干擾,致使團(tuán)頭魴群體內(nèi)部隔離;同時(shí),人工繁殖 (特別是近親繁殖)的子代放養(yǎng)或人工養(yǎng)殖的個(gè)體逃逸到湖泊中,打破了湖泊中原有的平衡。

本研究中篩選出的微衛(wèi)星多重PCR體系不僅可以應(yīng)用于團(tuán)頭魴群體的遺傳多樣性分析和群體遺傳關(guān)系研究,還可為親子鑒定平臺(tái)的建立以及分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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Establishment and application of microsatellite multilex PCR system for bluntsnout black bream Megalobrama ambl?ycephala

LUO Wei1,GAO Ze-xia1,ZENG Cong1,DENG Wei1, YIShao-kui1,QIAN Xue-qiao2,WANGWei-min1
(1.Key Lab of Agricultural Animal Genetics,Breeding and Reproduction,Ministry of Education,Key Lab of Freshwater Animal Breeding,Ministry of Agriculture,College of Fisheries,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Guangdong Haida Group Co.,Ltd.,Guangzhou 511400,China)

Six multiplex-PCR-sets including two tetraploid and four triplex combinations were developed from 20 microsatellitemarkers in bluntsnout black breamMegalobrama amblycephalabased on electrophoresis analysis of PCR products in denaturing polyacrylamide gels and visualization by silver-staining.Then genetic variability of these microsatellites was examined in wild population of bluntsnout black bream in Yuni Lake.The number of alleles at 20 loci was shown to vary from 3 to 9 with an average of5.8 alleles per locus,withmean polymorphic information content value of 0.601 and themean observed value of 0.77 and expected heterozygo site of 0.72,indicating that the bluntsnout black bream had middle level genetic diversity,and that there were 9 loci,significantly deviated from Hardy-Weinberg equilibrium(P＜0.05)in 20 loci.These optimized multiplex-PCR-sets provide a technical basis for genetic diversity study and parentage test of bluntsnout black bream.

Megalobrama amblycephala;microsatellite;multiplex PCR;genetic diversity

S917.4

A

2095-1388(2013)05-0418-06

2013-02-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31201988);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng) (CARS-46-05);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2011PY023);廣東海大集團(tuán)團(tuán)頭魴育種專項(xiàng)

羅偉 (1986-),男,博士研究生。E-mail:lwdjn@live.cn

王衛(wèi)民 (1959-),男,教授。E-mail:wangwm@mail.hzau.edu.cn