汪少蕓，趙立娜，周焱富，饒平凡

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350002)

眾多食品在低溫冷鏈上的冷凍、貯存、運(yùn)輸和凍融過(guò)程中的冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶問(wèn)題是制約產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵[1-4]。溫度的反復(fù)波動(dòng)使產(chǎn)品不斷遭受冰晶生長(zhǎng)、凍融和重結(jié)晶，損傷細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，使產(chǎn)品失去應(yīng)有的品質(zhì)，其導(dǎo)致的質(zhì)量破壞和巨大經(jīng)濟(jì)損失越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1-3]。如何控制低溫冷鏈過(guò)程中產(chǎn)品的冰晶生長(zhǎng)及重結(jié)晶，是保證眾多食品在低溫運(yùn)輸和貯存過(guò)程中品質(zhì)不發(fā)生劣變的關(guān)鍵[1-2]。

抗凍蛋白是一類附著在冰晶體表面而抑制冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶的活性蛋白質(zhì)[5-7]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)抗凍蛋白的研究十分活躍[8-14]。目前的研究主要集中在從極地魚類[15-17]、陸地昆蟲[18-19]、植物[20-21]和細(xì)菌[22]等生物體中分離到多種抗凍蛋白，并尋求它們?cè)谑称贰⑨t(yī)學(xué)和其他工業(yè)上的應(yīng)用[6,23]。天然分離純化得到的抗凍蛋白數(shù)量極少，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。當(dāng)科學(xué)家致力于轉(zhuǎn)基因技術(shù)以提高生物體來(lái)源的抗凍蛋白產(chǎn)量時(shí)，轉(zhuǎn)基因抗凍蛋白在食品應(yīng)用中的安全性顧慮則成為廣大消費(fèi)者、歐盟組織和食品藥品管理組織(FDA)共同擔(dān)憂的焦點(diǎn)[2,22]。研究[24-25]表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域中，并不是整體蛋白質(zhì)在起作用，因此，如何獲得食品源的結(jié)構(gòu)緊湊的高活性抗凍多肽，已成為抗凍蛋白新的研究方向。

本實(shí)驗(yàn)以食用明膠為原材料，通過(guò)控制內(nèi)切蛋白酶的酶解條件，使之產(chǎn)生具有特定的肽鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)組成的活性多肽，使抗凍活性得以高效實(shí)現(xiàn)，以期為食品源抗凍多肽的制備提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食源性明膠(225B40牛明膠) 美國(guó)Sanofi生物有限公司；冰淇淋基體為自制，其配方為：l2%乳脂、9%～12%脫脂奶粉、10%～16%蔗糖、0.1%乳化劑，其余為水。

堿性蛋白酶(EC 3.4.22.2，酶活力264U/g) 美國(guó)Sigma試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜柱(100cm×2.6cm，(100～300)μm)、SP Sephadex C-25離子交換色譜(55cm×2.0cm，(40～120)μm) 美國(guó)Pharmacia公司；Bondapak C18高效液相色譜柱(250mm×4.6mm，10μm) 美國(guó)Waters公司；多倍低溫顯微鏡、自動(dòng)照相系統(tǒng) 日本Nike公司；MALDI-TOF質(zhì)譜儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 抗凍活性檢測(cè)體系的確定

利用抗凍活性冷-熱循環(huán)(cold-heat-stage)檢測(cè)系統(tǒng)，結(jié)合多倍低溫顯微鏡和自動(dòng)照相系統(tǒng)，組構(gòu)抑制冰晶生長(zhǎng)的抗凍活性檢測(cè)系統(tǒng)。以液氮維持操作過(guò)程中的低溫環(huán)境。以每3min為1個(gè)循環(huán)使其保持在―14～―12℃之間，模擬產(chǎn)品在低溫貯存運(yùn)輸過(guò)程中的溫度波動(dòng)。利用冰淇淋基體為研究載體，將樣品置于載玻片上，記錄樣品在冷熱循環(huán)過(guò)程中的冰晶生長(zhǎng)實(shí)時(shí)圖片，并與空白對(duì)照組作比較；利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)冰晶的平均直徑和面積進(jìn)行顯著性分析，計(jì)算其晶體生長(zhǎng)差異的規(guī)律性。冰晶的數(shù)目及大小較空白對(duì)照組樣品減少，則表明樣品具有抑制冰晶生長(zhǎng)的能力。共進(jìn)行7次循環(huán)，顯微像320倍予以記錄。

1.3.2 抗凍多肽的制備條件單因素試驗(yàn)

配制20%的明膠溶液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，控制pH9.0，分別優(yōu)化酶與底物比、酶解時(shí)間、酶解溫度等抗凍多肽制備條件。酶解結(jié)束后將水解液在沸水中處理5min，即終止水解。

1.3.2.1 明膠酶解制備抗凍多肽的料液比單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，控制酶解溫度37℃、pH 9.0、酶解時(shí)間30min，酶與底物比分別為1：100、1：50、1：25、1：15和1：10時(shí)，測(cè)定不同酶與底物比條件下酶解物抑制冰晶生長(zhǎng)情況，計(jì)算抗凍活性大小，確定明膠酶解制備抗凍多肽的料液比。

1.3.2.2 明膠酶解制備抗凍多肽的酶解時(shí)間單因素試驗(yàn)

控制酶解溫度37℃、pH9.0、酶與底物比1：15，酶解時(shí)間分別為10、20、30、40、60min時(shí)，測(cè)定不同酶解時(shí)間條件下的抑制冰晶生長(zhǎng)情況，計(jì)算抗凍活性大小，確定明膠酶解制備抗凍多肽的酶解時(shí)間。

1.3.2.3 明膠酶解制備抗凍多肽的酶解溫度單因素試驗(yàn)

控制酶解時(shí)間30min、pH9.0、酶與底物比1：15，酶解溫度分別為37、45、55℃時(shí)，測(cè)定不同酶解溫度條件下的抑制冰晶生長(zhǎng)情況，計(jì)算抗凍活性大小，確定明膠酶解制備抗凍多肽的酶解溫度。

1.3.3 抗凍多肽的分離純化

1.3.3.1 凝膠色譜

抗凍多肽酶解物用Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜柱進(jìn)行分離，洗脫液為pH7.0 0.01mol/L的磷酸緩沖液(PBS)，以1mL/min流速收集樣品(5mL/管)，測(cè)定樣品在225nm波長(zhǎng)處的吸收值，繪制洗脫曲線。分別測(cè)定所收集樣品的抑制冰晶生長(zhǎng)情況，計(jì)算冰晶尺寸，并用來(lái)表示抗凍活性大小。

1.3.3.2 離子交換色譜

收集Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜分離的抗凍活性組分，采用SP Sephadex C-25離子交換色譜進(jìn)一步分離，樣品平衡液為pH5.4 0.01mol/L的PBS緩沖液，用0～0.5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。以1mL/min流速收集樣品(5mL/管)，測(cè)定樣品在225nm波長(zhǎng)處的吸收值，繪制洗脫曲線。分別測(cè)定所收集樣品的抑制冰晶生長(zhǎng)情況，計(jì)算冰晶尺寸，并用來(lái)表示抗凍活性大小。

1.3.3.3 反相高效液相色譜

收集SP Sephadex C-25離子交換色譜的抗凍活性組分，采用C18高效液相色譜柱進(jìn)一步分離；進(jìn)樣量為100μL；流動(dòng)相的A液為去離子水，B液為乙腈；流速為3.0mL/min，測(cè)定樣品在225nm波長(zhǎng)處的吸收值，繪制洗脫曲線。分別測(cè)定所收集樣品的抑制冰晶生長(zhǎng)情況，計(jì)算冰晶尺寸，并來(lái)表示抗凍活性大小。

1.3.4 質(zhì)譜鑒定

收集分別通過(guò)Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜、SP Sephadex C-25離子交換色譜和C18高效液相色譜柱分離的強(qiáng)抗凍活性的特異性多肽，利用MALDI-TOF質(zhì)譜，鑒定其分子質(zhì)量大小。

1.3.5 氨基酸序列測(cè)定

利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀，根據(jù)Edman降解法測(cè)定強(qiáng)抗凍活性特異性多肽的氨基酸全序列，并分析序列結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗凍多肽的制備條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解制備抗凍多肽的酶與底物比優(yōu)化

圖 1 不同酶與底物比條件下酶解物的抑制冰晶生長(zhǎng)圖Fig.1 Effect of gelatin hydrolysate from different [E]/[S] ratios on the growth of ice crystal in ice cream.

圖 2 不同酶與底物比的明膠酶解物的冰晶抑制結(jié)果Fig.2 Inhibitory effect of gelatin hydrolysate from different [E]/[S] ratios on the growth of ice crystal

由圖1、2可知，隨著酶與底物比逐漸增大，產(chǎn)生的冰晶尺寸逐漸減少，當(dāng)酶與底物比為1：10時(shí)，冰晶則出現(xiàn)增大趨勢(shì)。采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)計(jì)算冰晶尺寸的平均大小，可以直觀看出抗凍活性大小。因此確定明膠酶解制備抗凍多肽的最適酶與底物比為1：15。

2.1.2 酶解制備抗凍多肽的酶解時(shí)間優(yōu)化

由圖3、4可知，當(dāng)酶解時(shí)間從10min延長(zhǎng)至20、30min時(shí)，冰晶的尺寸逐漸減少，抗凍活性逐漸增加；而當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)增大至40、60min時(shí)，產(chǎn)生的酶解液冰晶尺寸增大，抗凍活性下降。所以明膠酶解制備抗凍多肽的酶解時(shí)間以30min為宜。

圖 4 不同酶解時(shí)間的明膠酶解物的冰晶抑制結(jié)果Fig.4 Inhibitory effect of gelatin hydrolysate from different hydrolysis time on the growth of ice crystal

2.1.3 酶解制備抗凍多肽的酶解溫度優(yōu)化

圖 5 不同酶解溫度條件下酶解物的抑制冰晶生長(zhǎng)圖Fig.5 Effect of gelatin hydrolysate from different temperatures on the growth of ice crystal in ice cream

圖 6 不同酶解溫度條件下的明膠酶解物的冰晶抑制結(jié)果Fig.6 Inhibitory effect of gelatin hydrolysate from different temperatures on the growth of ice crystal

由圖5、6可知，45℃酶解液的冰晶尺寸最小，生長(zhǎng)抑制能力最強(qiáng)。因此優(yōu)化出制備抗凍多肽的酶解溫度為45℃。

2.2 抗凍多肽的分離純化

2.2.1 凝膠色譜

圖 7 Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜分離圖Fig.7 Elution pattern of Sephadex G-50

圖 8 Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜分離組分F1、F2和F3的抑制冰晶生長(zhǎng)情況Fig.8 Effect of fractions 1, 2 and 3 from Sephadex G-50 on the growth of ice crystal

由圖7、8可知，根據(jù)F1、F2、F3洗脫峰的抑制冰晶生長(zhǎng)情況，可以得到洗脫峰F3的抗凍活性最顯著(P＜0.05)。

2.2.2 離子交換色譜

圖 9 SP Sephadex C-25離子交換色譜分離圖Fig.9 Elution pattern of Sepharose SP C-25

圖 10 SP-Sephadex C-25離子交換色譜分離組分S1和S2的抑制冰晶生長(zhǎng)圖Fig.10 Effect of fractions 1 and 2 from SP-Sephadex C-25 on the growth of ice crystal

如圖9、10所示，對(duì)洗脫峰S1、S2充分透析脫鹽，根據(jù)其其抑制冰晶生長(zhǎng)情況，得到洗脫峰S2的抗凍活性最顯著(P＜0.05)。

2.2.3 反相高效液相色譜

圖 11 C18-HPLC 色譜分離圖Fig.11 Elution pattern of C18-HPLC

圖 12 C18 RPLC色譜分離組分C1和C2的抑制冰晶生長(zhǎng)圖Fig.12 Effect of fractions C1 and C2 from C18-HPLC on the growth of ice crystal

如圖11、12所示，對(duì)收集的樣品充分去除揮發(fā)性溶劑后，通過(guò)抑制冰晶生長(zhǎng)情況計(jì)算抗凍活性大小，得到洗脫峰C2的抗凍活性最顯著(P＜0.05)。

2.3 質(zhì)譜鑒定

圖 13 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定抗凍多肽分子質(zhì)量Fig.13 Molecular weight (MW) of antifreeze fraction C2 by MALDI-TOF

由圖13可知，具有顯著活性的抗凍多肽分子質(zhì)量為 2107D。

2.4 氨基酸序列分析

根據(jù)Edman降解法測(cè)定強(qiáng)抗凍活性特異性多肽的氨基酸全序列，并進(jìn)行序列分析，獲得其氨基酸全序列即一級(jí)結(jié)構(gòu)為：GERGFPGERGSPGAQGLQGPR。

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理推測(cè)

具有特定氨基酸長(zhǎng)度和序列的強(qiáng)抗凍活性多肽C2，其來(lái)源于食源性明膠。明膠來(lái)源于膠原蛋白，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)是三股α螺旋結(jié)構(gòu)，故推測(cè)明膠多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為α螺旋，具有α螺旋的強(qiáng)抗凍活性多肽的螺旋鏈中—NH基團(tuán)和冰分子的—OH形成氫鍵—N—H…O—H(圖14)，多肽通過(guò)氫鍵結(jié)合于冰核棱晶的表面，從而抑制了其生長(zhǎng)。而且，分子質(zhì)量2107D的肽鏈具有足夠的親水性、柔韌性，加上明膠多肽富含的脯氨酸和丙氨酸殘基的烷基側(cè)鏈可以提供部分的非極性環(huán)境通過(guò)疏水作用以穩(wěn)定多肽和冰之間形成的氫鍵[12-13]，并能夠?qū)贡g氫鍵相互作用的競(jìng)爭(zhēng)性，使之表現(xiàn)出顯著的冰晶抑制活性。

圖 14 抗凍多肽與冰結(jié)構(gòu)分子表面形成氫鍵的模型Fig.14 Model of hydrogen bonds between antifreeze peptide and the surface of ice molecules

3 結(jié) 論

以食源性明膠為原材料，通過(guò)控制堿性蛋白酶的酶解條件，使之酶切為特定的活性多肽，使得抗凍活性得以高效實(shí)現(xiàn)。對(duì)得到的抗凍多肽溶液通過(guò)Sephadex G-50、SP Sephadex C-25、C18RPLC色譜分離和MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，最終得到分子質(zhì)量為2107D的強(qiáng)抗凍活性多肽。其可能的作用機(jī)理為具有α螺旋的強(qiáng)抗凍活性多肽在冰晶的棱晶面內(nèi)與水分子形成氫鍵，多肽通過(guò)氫鍵結(jié)合于冰核棱晶的表面，從而抑制冰晶長(zhǎng)大。本研究結(jié)果將為食源性抗凍多肽的制備及探索其在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

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