陳 明，徐幸蓮，周光宏，湯曉艷*，袁 飛，陳愛亮

(1.中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，農業(yè)部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081；2.南京農業(yè)大學食品科技學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123)

沙門氏菌(Salmonella)是對人類和動物健康危害嚴重的一類致病菌，在美國，沙門氏菌已被實驗室證實是最重要的食源性致病菌，而在歐洲，沙門氏菌也成為最主要的致病菌之一[1-3]。在引起沙門氏菌中毒的食品中，以動物性食品污染最為嚴重[4-5]。感染了沙門氏菌的患者輕則引起腹瀉、惡心，重則導致傷寒、敗血性休克，甚至死亡[6-8]。引起人類疾病的沙門氏菌血清型主要為腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌[9-13]。本研究選擇含有屬特異性共同抗原表位的鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得沙門氏菌鞭毛融合蛋白，純化后以此融合蛋白作為抗原制備多克隆抗體，為進一步研究沙門氏菌免疫學檢測方法和試劑盒的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質粒及實驗動物

鼠傷寒沙門氏菌菌株S. typhimurium(從雞肉中分離) 中國檢驗檢疫科學院；質粒載體pET28a(+)由本實驗室保存；表達菌株BL21(DE3)pLysS 天根生化科技(北京)有限公司。

BALB/c小鼠，6～8周齡，由中國檢驗檢疫科學院動物中心提供。

1.1.2 試劑

DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP 美國NEB公司；細菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、蛋白質分子質量標準 天根生化科技(北京)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、弗氏佐劑及弗氏不完全佐劑 美國Sigma公司；Ni-NTA樹脂 德國Qiagen公司；PVDF膜和顯色試劑 生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因fliC引物的設計與合成

根據(jù)PCR引物設計的原則，利用Primer Premier 5.0軟件對經NCBI數(shù)據(jù)庫篩選的沙門氏菌屬內同源性較高的鼠傷寒沙門氏菌目的基因fliC(AY353377.1)進行引物設計，上游引物(FLICF)：5’-GGCAGCCATATGGCACAAGTC ATTAATACAAACAGCCTGT-3’，劃線處為NdeⅠ酶切位點，下游引物(FLICR)：5’-GTGGTGCTCGAGACGCA GTAAAGAGAGGACGTTTTGCGGAA-3’，劃線部分為XhoⅠ限制性內切酶位點，以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 總DNA的提取及鞭毛蛋白基因的擴增

利用天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組提取試劑盒從新鮮的沙門氏菌菌液中提取沙門氏菌基因組，并以此為模板進行目的基因的擴增，PCR反應程序：94℃、5min；94℃、1min，60℃、45s，72℃、90s，32個循環(huán)；72℃、7min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 融合表達載體的構建與測序

用N d e Ⅰ和X h o Ⅰ雙酶切P C R 產物和表達載體pET28a(+)，將膠回收純化的載體酶切產物和PCR酶切產物進行連接，構建融合表達質粒pET28a-fliC，轉入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，涂于含20μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。取陽性克隆進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。

1.2.4 表達載體在大腸桿菌中的表達及可溶性分析

挑取含重組質粒的陽性克隆菌株，過夜培養(yǎng)，次日按1：100轉種至100mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)3h至A600nm達0.6～0.8，加入誘導劑IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)振搖6h。培養(yǎng)結束后12000r/min離心5min，收集菌體沉淀。將菌體沉淀重懸于細菌裂解液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH8.0)中，超聲波破碎后12000r/min離心10min，收集上清液和沉淀。分別取少量上清液和沉淀進行SDSPAGE電泳分析。

1.2.5 親和層析純化融合蛋白

根據(jù)1.2.4節(jié)的步驟將含重組質粒的陽性菌株擴增培養(yǎng)至500mL，誘導表達后，離心收集沉淀，將其用細菌裂解液溶解后進行超聲破碎，離心取上清，根據(jù)Ni-NTA瓊脂糖樹脂操作說明對上清液進行純化。具體步驟參考Qiagen公司Ni-NTA樹脂使用說明。經純化的蛋白用SDS-PAGE進行電泳分析。

1.2.6 Western-blotting鑒定

將純化產物經10% SDS-PAGE電泳后，濕轉法轉印至PVDF膜上，在含5g/100mL脫脂奶的PBST中4℃封閉過夜，以鼠抗His標簽單抗為第一抗體，室溫結合1h，TBST洗3次，每次10min，再加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG，室溫結合1h，TBST洗3次，每次10min，用 ECL顯色試劑對表達產物進行顯色鑒定。

1.2.7 FliC融合蛋白多克隆抗體的制備

選3只體質量為6～8周齡的健康雌性和雄性BALB/c小鼠，對小鼠進行多點皮下注射，50μg/只。每隔2周加強免疫1次，此時免疫原改用弗氏不完全佐劑進行乳化。從第2次加強免疫后開始監(jiān)測血清，于第3次加強免疫后7d尾部靜脈采血，用間接ELISA檢測抗血清。待血清效價穩(wěn)定后，斷頭采血，分離血清，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 間接ELISA法測定抗血清效價

用包被緩沖液(pH9.6、0.05mol/L碳酸鹽緩沖液)稀釋的抗原包被酶標板，4℃過夜；以含3g/100mL脫脂奶粉的封閉液37℃封閉1h；依次加入倍比(100、1000、10000、100000)稀釋的抗血清，37℃溫育30min，洗滌，同時設空白對照和陰性血清對照；加入稀釋(1：4000)的羊抗鼠IgG-HRP，37℃溫育2h，最后以TMB為底物顯色置室溫暗室處10min最后加50μL終止液(2mol/L H2SO4)，用酶標儀測定各孔OD450nm值。

1.2.9 抗血清特異性的鑒定

以10種沙門氏菌(含目標菌)和10種非沙門氏菌屬的常見食物中毒菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等)為包被原包被酶標板，同時做陰性對照，用間接ELISA法測定各孔的OD450nm值，具體操作步驟同1.2.8節(jié)。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

圖 1 PCR產物凝膠電泳結果Fig.1 Analysis of PCR products by 1% agarose gel electrophoresis

本實驗用所設計的引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果見圖1，可以看出1條特異性的DNA條帶，大小與預期值1509bp大小相吻合。

2.2 重組質粒pET28a-fliC酶切鑒定和測序驗證

圖 2 重組表達載體的雙酶切鑒定結果Fig.2 Identification of recombinant expression vectors by double enzyme digestion

用質粒小提試劑盒提取重組質粒進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，經0.8%瓊脂糖電泳檢測共出現(xiàn)2條帶，分別與載體和預期fliC目的基因片段的大小相符(圖2)，提示重組質粒構建成功。重組質粒pET28a-fliC的fliC基因經測序，全長為1509bp，結合載體序列進行分析，確定其開放讀碼框架正確，無移碼和突變現(xiàn)象，進一步證明載體構建成功。

2.3 重組質粒的表達和可溶性分析

將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，加入誘導劑IPTG，參考文獻[14]的誘導時間誘導6h，收集細胞裂解后進行SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，在40.0～60.0kD間，誘導組菌體蛋白較對照組出現(xiàn)明顯誘導條帶(圖3)，其分子質量大小與預期(54.6kD)基本相符?？扇苄苑治鼋Y果表明，融合蛋白大部分存在于裂解液上清液中(圖4)。

圖 3 融合蛋白表達的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis for the expression of fusion protein

圖 4 重組蛋白表達形式的鑒定Fig.4 Identification of the recombinant proteins

2.4 重組蛋白的純化及Western-blotting鑒定

陽性克隆菌經IPTG誘導后，經超聲裂解，收集超聲后的上清液，經Ni-NTA樹脂純化，收集洗脫液用SDSPAGE分析，純度較高(圖5)。Western-blotting結果(圖6)顯示，純化后所得蛋白可被His-Tag抗體識別，說明表達的重組蛋白帶有His-Tag，空質粒對照并未出現(xiàn)誘導條帶。

圖 5 純化的重組蛋白的SDS-PAGE分析 Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified proteins

圖 6 純化的重組蛋白的Western-blotting分析Fig.6 Western-blotting analysis of the purified proteins

2.5 血清效價的測定結果

小鼠經4次免疫后，尾靜脈取血檢測，用間接ELISA進行效價測定，根據(jù)P/N≥2.1，陽性血清的最大稀釋比例為抗血清的效價，結果表明3只小鼠血清抗體效價達到1：32000，其中第2只小鼠的抗血清效價達1：128000，具體結果見表1。

表 1 間接ELISA檢測抗體效價結果 Table 1 Results obtained for the assay of titer by indirect ELISA

2.6 抗體特異性檢測結果

表 2 間接ELISA檢測抗體特異性結果Table 2 Results obtained for the analysis of specificity by indirect ELISA

由表2可知，制備的抗血清與6種非沙門氏菌屬的常見食品中致病菌無陽性反應，與10種沙門氏菌中的6株有陽性反應，這6株菌分別為：鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、紐波特沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和阿伯丁沙門氏菌。

3 討 論

本實驗將PCR得到的目的片段測序，通過生物信息學方法預測其編碼蛋白序列，發(fā)現(xiàn)了TDKN GKSIDGGY這一肽段，通過相關軟件的比對發(fā)現(xiàn)其與沙門氏菌屬特異性共同抗原表位TDNNGKTIDGGL位點具有同源性，這與文獻[15]報道的一致。原核細胞表達系統(tǒng)具有成本低、周期短、操作簡便等許多優(yōu)點,而pET系統(tǒng)在E. coli 中克隆表達重組蛋白具有很大的優(yōu)勢，主要表現(xiàn)為表達效率高，可在短時間內誘導出大量的目的蛋白。本研究利用pET28a(+)表達了C端和N端融合了6×His的沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC，并利用Ni-NTA親和純化方法得到了較純的目的蛋白，經SDS-PAGE和Western-blotting鑒定證明，該蛋白的大小和預計大小相符。

本研究采用His-Tag標記的質粒pET28a(+)載體進行表達，His-Tag分子質量小，免疫原性小，不影響目的蛋白的活性，且方便后續(xù)的純化和鑒定[16]。表達的His-Tag融合蛋白無論是可溶性的或者包涵體形式都可以用Ni-NTA樹脂去純化，Ni-NTA樹脂具有特異性好、流速快、顆粒度均勻、粒徑小、螯合鎳穩(wěn)定、物理和化學穩(wěn)定性好、批次重復性好等優(yōu)點。本實驗表達的目的蛋白經SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，大部分以可溶性形式存在。這與饒星等[14]在相關研究中表達出的以包涵體形式存在的鞭毛蛋白不同，可溶性蛋白的純化過程相對簡單,無需像包涵體形式蛋白純化那樣經歷變性、復性等復雜過程[17]。

要制備高效價、高特異性的抗體必須有理想的免疫原、合適的免疫動物和切實可行的免疫方案。蛋白質是良好的抗原，前期實驗獲得的鞭毛融合蛋白經過親和層析純化，可作為免疫原免疫小鼠制備抗血清。

佐劑是一種非特異性的免疫增強劑，當其與抗原一起注入機體時，可增強機體應答反應。佐劑的作用原理為：1)改變抗原的物理性狀，增加抗原在體內儲留時間；2)通過刺激單核-巨噬細胞，增加APC對抗原的處理和提呈能力；3)誘發(fā)抗原注射部位及其局部淋巴結的炎癥反應，有利于刺激免疫細胞的增殖作用；4)刺激淋巴細胞的增殖分化，從而增強和擴大免疫應答的能力[18-19]。本實驗中用于乳化抗原的佐劑即為弗氏佐劑，在初次免疫時，使用弗氏完全佐劑，加強免疫時使用弗氏不完全佐劑，以利于抗原持續(xù)刺激動物機體，產生高濃度的特異性IgG型免疫球蛋白。

免疫間隔時間是影響免疫效果的重要因素。第一次免疫后，因動物機體正處于抗原識別和特異性B細胞增殖階段，若很快進行第二次抗原注入，極易引起免疫抑制。所以一般以間隔10～20d為宜。第二次免疫注射后，每次加強免疫的間隔時間一般為7～10d，不能太長，以防刺激變弱，抗體效價不高。加強免疫兩次后就可進行試血，如抗血清效價符合要求，應在末次免疫后5～7d及時采血，否則抗體效價將會下降[20]。本實驗初次免疫小鼠后2周，進行加強免疫，然后每隔2周進行一次加強免疫，在第四次加強免疫后的第7天取血用間接ELISA測定效價。結果表明用純化的鞭毛融合蛋白免疫小鼠后得到的抗血清，效價可達1：32000以上，為進一步建立沙門氏菌屬的免疫學檢測方法提供了前期參考。

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