韓學易，唐自鐘，王麗華，陳 惠*

(四川農業(yè)大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014)

角蛋白是一種具有極強抗性難降解的硬蛋白，主要存在于動物的毛發(fā)、羽毛及鱗片等組織中，其化學結構穩(wěn)定，難以被一般的蛋白酶所降解[1-2]，這樣極大地阻礙了角蛋白資源的有效利用。角蛋白酶具有降解天然角蛋白的特性，可專一地降解角蛋白[3-4]，使其在食品、醫(yī)藥、飼料和制革等工業(yè)中得到廣泛應用，并可降解瘋牛病和人類克雅氏癥的Prion蛋白[5-6]，成為目前研究熱點，應用價值巨大。近年來，能夠分泌角蛋白酶的菌株被陸續(xù)分離鑒定，具有潛在應用價值的基因被陸續(xù)克隆表達[7-9]。在角蛋白酶基因的表達研究中，巴斯德畢氏酵母表達系統(tǒng)有胞外分泌型，根據(jù)外源蛋白特性選擇合適的表達菌株和載體，可以實現(xiàn)外源蛋白的高效表達[10-11]，并且操作簡單，表達水平穩(wěn)定，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

目前角蛋白酶的研究主要集中在菌種篩選、酶學性質等方面，已經(jīng)報道的角蛋白酶表達菌株活性相對較低，大規(guī)模生產(chǎn)應用未見報道。本實驗室前期已篩選出產(chǎn)角蛋白酶的枯草芽孢桿菌B-3，成功克隆角蛋白酶基因kerC，構建了大腸桿菌表達載體BL21-pET-kerC，實現(xiàn)其在大腸桿菌BL21中的異源表達，但酶活力提高并不明顯。本研究將角蛋白酶基因kerC構建于表達載體pPICZαA上，電擊轉入畢氏酵母X-33，實現(xiàn)其在真核表達系統(tǒng)中的高效表達，以期為進一步角蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、畢赤酵母(Pichia pastoris)X-33、質粒pET-kerC和克隆載體、pPICZαA 美國Invitrogen公司；pMD19-T Simple Vector 寶生物工程(大連)有限公司。

各種DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA和蛋白質分子質量標準品 寶生物工程(大連)有限公司；Taq DNA聚合酶 天根生化科技有限公司；DNA膠回收試劑盒 上海Omega生物技術有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純或進口分裝；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

大腸桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，轉化子篩選用氨芐青霉素抗性和博萊霉素抗性，終質量濃度分別為100、25μg/mL；酵母培養(yǎng)用YPD培養(yǎng)基和BMGY培養(yǎng)基，產(chǎn)酶培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設備

MyCyclerTM PCR儀、電穿孔儀、GelDoc凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；D-37520高速冷凍離心機 美國Thermo公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 角蛋白酶基因kerC片段的擴增

由角蛋白酶基因kerC序列，設計PCR擴增特異引物，Up：5'-CCGGAATTCGCCGGAAAAAGCAGTACAGA-3’，下劃線為EcoRⅠ酶切位點，Down：5’-AGGTCTAGATT ATTGTGCAGCTGCTTGTAC-3’，下劃線為XbalⅠ酶切位點。

1.4 角蛋白酶基因kerC重組表達載體的構建

利用XbalⅠ和EcoRⅠ雙酶切得到的kerC基因片段，連接到經(jīng)相同雙酶切處理的表達載體pPICZαA，得到重組表達質粒，線性化后電擊轉化畢赤酵母X-33，挑取Zeocin抗性篩選得到的陽性轉化子，擴大培養(yǎng)，提取總DNA，并以總DNA為模板，用通用引物進行PCR篩選鑒定陽性轉化子。

1.5 重組角蛋白酶的SDS-PAGE分析

將重組菌株接種于BMGY培養(yǎng)基，于30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h后作為種子液接入BMMY誘導培養(yǎng)基，每隔24h添加甲醇使甲醇的終體積分數(shù)為1%，108h后離心收集上清即為粗酶液。將粗酶液透析濃縮后，用DEAE纖維素陰離子柱純化，收集有酶活力的洗脫峰，經(jīng)透析濃縮后作為SDS-PAGE上樣液。電泳時制備12%的分離膠和5%的濃縮膠進行，同時點上粗酶液和空質粒對照組進行SDS-PAGE分析。

1.6 重組角蛋白酶活力測定

參考Vermelho等[12]方法，并作改進：取1mL發(fā)酵液上清，加入2mL Tris-HCl緩沖液配制的羽毛粉底物，于50℃恒溫振蕩水浴鍋中反應1h，加入2mL 20%三氯乙酸(TCA)終止反應，4℃、10000r/min離心5min，在波長280nm處測定上清液吸光度。以滅活酶液作為對照。酶活力單位(U)定義：在以上反應條件下，吸光度每增加0.10為1U。

1.7 重組菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.7.1 甲醇誘導體積分數(shù)對產(chǎn)酶的影響

將角蛋白酶重組菌接種到不同甲醇體積分數(shù)(0.5%、0.7%、1.0%、1.5%、2.0%)的BMMY誘導培養(yǎng)基中，每隔24h加入甲醇使其達到相應體積分數(shù)， 108h后取上清液測其酶活力。

1.7.2 誘導時間對產(chǎn)酶的影響

將角蛋白酶重組菌接種到BMMY誘導培養(yǎng)基，按1.0%甲醇進行誘導培養(yǎng)，分別在不同時間(72、84、96、108、120、132h)收集上清測定酶活力。

1.8 重組角蛋白酶的酶學性質分析

1.8.1 重組角蛋白酶作用的最適溫度和熱穩(wěn)定性

分別在不同溫度(30、40、50、55、60、65、70、80℃)條件下測定重組角蛋白酶活力，并在以上溫度條件下將重組角蛋白酶保溫30min后于50℃反應1h測定剩余酶活力分析其熱穩(wěn)定性。

1.8.2 重組角蛋白酶作用的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

在不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0)條件下分析重組角蛋白酶活力變化，將該酶分別在以上pH值環(huán)境條件下保溫30min后測定酶活力分析其pH值穩(wěn)定性。

1.8.3 金屬離子對重組角蛋白酶作用的影響

在含有3mmol/L不同金屬離子的環(huán)境中，測定重組角蛋白酶的酶活力，以未加金屬離子的酶活力為100%。

2 結果與分析

2.1 角蛋白酶基因的克隆及表達載體的構建

以質粒pET-kerC為模板，高保真酶擴增kerC基因序列，將其連接T載體后，轉化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR篩選陽性轉化子。將質粒pPICZαA與T-kerC同時進行XbalⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收、連接，轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR和酶切鑒定結果。如圖1表明，kerC基因成功連接到表達載體pPICZαA，命名為pPICZαAkerC。將重組表達載體線性化后，電轉畢赤酵母X-33，經(jīng)含Zeocin抗性的YPD平板篩選，以總DNA為模板，用通用引物進行PCR擴增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析其條帶大小為1000bp左右即為陽性轉化子。電泳結果表明表達載體pPICZαA-kerC成功轉入到畢赤酵母X-33中。

圖 1 菌落PCR鑒定(A)和表達載體pPICZαA-kerC的酶切分析(B)Fig.1 PCR identification of colonies (A) and restriction enzyme analysis of plasmid pPICZαA-kerC (B)

2.2 角蛋白酶基因的誘導表達

2.2.1 甲醇誘導體積分數(shù)對產(chǎn)酶的影響

圖 2 不同體積分數(shù)甲醇誘導下角蛋白酶的活性Fig.2 Effect of methanol concentration on keratinase activity

由圖2可知，當甲醇誘導體積分數(shù)為1%時酶活力達到最大，甲醇體積分數(shù)超過1%時，隨著甲醇體積分數(shù)的升高，酶活力迅速下降。因此，重組酶最佳甲醇誘導體積分數(shù)為1%。

2.2.2 誘導時間對產(chǎn)酶的影響

圖 3 不同時間誘導下角蛋白酶的活性Fig.3 Effect of induction time on keratinase activity

由圖3可知，隨著誘導時間的延長，角蛋白酶活力不斷升高。當誘導培養(yǎng)時間達到108h時，酶活力達到最大，其后隨著時間的延長，酶活力逐漸降低，108h為重組酶產(chǎn)酶最佳誘導時間。

圖 4 重組角蛋白酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant keratinase

2.2.3 SDS-PAGE分析經(jīng)DEAE-纖維素柱層析純化后的重組角蛋白酶進行SDS-PAGE分析。由圖4可知，重組酶分子質量約31kD，與經(jīng)ExPASy Proteomics Server軟件對重組角蛋白酶的氨基酸序列進行分子質量預測值接近(36.1kD)。

2.3 重組角蛋白酶的性質分析

2.3.1 重組角蛋白酶作用的最適溫度和熱穩(wěn)定性

圖 5 溫度對重組角蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on activity of the recombinant keratinase

圖 6 重組角蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of the recombinant keratinase

由圖5可知，在不同溫度條件下測定重組角蛋白酶酶活力，結果表明其最適反應溫度為60℃。將重組角蛋白酶保溫30min后測定剩余酶活力，由圖6可知，重組角蛋白酶在30～65℃范圍內具有較高的熱穩(wěn)定性，高于65℃時酶活力開始下降，但在80℃時仍能達到最高酶活力的50%。

2.3.2 重組角蛋白酶作用的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖 7 不同pH值條件下重組角蛋白酶的酶活力Fig.7 Effect of pH on activity of the recombinant keratinase

圖 8 重組角蛋白酶的pH值穩(wěn)定性 Fig.8 pH stability of the recombinant keratinase

由圖7可知，重組角蛋白酶最適反應pH值為7.5。由圖8可知，重組角蛋白酶在pH7.0～8.5的范圍內比較穩(wěn)定，高于pH8.5，酶迅速失活。

2.3.3 金屬離子對重組角蛋白酶活力的影響

表 1 不同金屬離子對重組角蛋白酶活力的作用Table 1 Effect of different metal ions on activity of the recombinant keratinase

在含有不同金屬離子的環(huán)境中，測定重組角蛋白酶的酶活力，由表1可知，Ca2+、Co2+和Fe2+均可提高角蛋白酶的活力，在3mmol/L離子濃度反應條件下，酶活力分別提高0.31倍、1.89倍和12.64倍。Na+、Zn2+、Mn2+、K+、Cu2+和Mg2+對重組角蛋白酶活力有不同程度的抑制作用，而Fe3+完全抑制其酶活力。

3 討 論

目前，已有很多能產(chǎn)角蛋白酶的微生物被報道，角蛋白酶基因相繼被克隆，并且實現(xiàn)了異源表達，但表達量不高，酶活力相對較低。Lin等[13]將角蛋白酶kerA基因轉入B.subtilis菌株DB104中，轉化子FDB-29的角蛋白酶產(chǎn)量僅提高了3～5倍；Porres等[7]將Bacillus licheniformis PWD-1的kerA基因克隆到pPICZαA和pGAPZαA載體上，轉化畢赤酵母X-33，轉化子經(jīng)甲醇誘導，144h后產(chǎn)酶量為124mg/L；季金殿等[14]克隆了嗜麥芽窄食單胞茵S. maltophilia YHJ-1基因kerD，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達，酶活力為10.5U/mL。本研究從枯草芽孢桿菌B-3中克隆得到角蛋白酶基因kerC，構建了重組表達載體pPICZαA-kerC，轉化巴斯德畢赤酵母X-33，重組菌株以1%體積分數(shù)的甲醇誘導培養(yǎng)108h后，酶活力達到32.31U/mL，是原核表達菌株BL21-pET-kerC的11.15倍，表達效果優(yōu)于前述報道，成功實現(xiàn)了角蛋白酶的異源高效表達，為角蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎及提供依據(jù)。

已報道的角蛋白酶分子質量在16～440kD[15]范圍，大多數(shù)是30kD左右，最適pH值是pH7.5～l0.0，最適溫度范圍在30～75℃，多數(shù)在45～55℃[15]，不同來源的角蛋白酶酶學性質有一定差異。賴欣等[16]報道的角蛋白酶最適反應溫度和最適反應pH值分別為55℃和7.0，pH5.5～8.0時酶活力較穩(wěn)定，可達最大酶活力的70%以上；鄒曉鳳等[17]研究的角蛋白酶kerF分子質量為50kD，最適作用pH值和最適作用溫度分別為pH9.0和50℃；Radha等[18]報道的角蛋白酶分子質量大小分別為30kD和39kD，最適作用pH值和最適作用溫度分別為8.0和70℃；Cao Zhangjun等[19]純化得到的角蛋白酶分子質量約為35.2kD，最適作用pH值和最適作用溫度分別為7.8和40℃。本研究重組角蛋白酶kerC分子質量約為31kD，最適反應溫度和最適反應pH值分別為60℃和7.5，在30～65℃范圍內具有較高的熱穩(wěn)定性，80℃保溫30min后剩余酶活力仍達到最高酶活力的50%；在pH7.0～8.0范圍內能保持最高酶活力的80%以上，中性和弱堿性的條件下具有較好的pH值穩(wěn)定性。

微量金屬離子在一定程度上能增強或抑制角蛋白酶的酶活力。Li Jiang等[20]報道在1mmol/L Cu2+環(huán)境中，角蛋白酶sfp2活力增強49.4%，在1mmol/L Co2+、Fe2+和Ca2+環(huán)境中，酶活力受到一定程度的抑制。Lü Longxian等[21]報道1mmol/L的Co2+、Zn2+能增強Chryseobacterium L99角蛋白酶活力，但Ca2+、Fe3+對其活力有抑制作用。Balaji等[22]報道5mmol/L的Mn2+、Ca2+、Zn2+能顯著提高Bacillus subtilis MTCC(9102)角蛋白酶活力，但酶活力受到5mmol/L的Cu2+抑制。可見，相同的金屬離子作用不同來源的角蛋白酶，其結果存在差異。在本研究中，在3mmol/L離子環(huán)境中，Ca2+、Co2+和Fe2+可以增強重組角蛋白酶活力，而Fe3+卻完全抑制重組角蛋白酶活力，Na+、Zn2+、Mn2+、K+、Cu2+和Mg2+能在不同程度上抑制其酶活力。

本研究成功實現(xiàn)了枯草芽孢桿菌角蛋白酶基因的高效表達，為該基因的進一步研究和應用奠定了良好的基礎，實驗室期望通過進一步完善發(fā)酵和分離純化工藝，以及采用高密度發(fā)酵培養(yǎng)等技術，以最大化提高角蛋白酶的產(chǎn)量和活性，使其能最終應用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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