朱龍寶，葛 飛，李婉珍，陶玉貴*

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

L-乳酸及其衍生物廣泛應用于食品、日用化工、制藥、紡織、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等諸多領域。目前工業(yè)生產(chǎn)乳酸方法主要有化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶轉化法[1-2]，其中發(fā)酵生產(chǎn)乳酸菌是最具潛力的一種生產(chǎn)方式。主要的生產(chǎn)菌種是乳酸桿菌，體內的乳酸脫氫酶是糖酵解途徑中的丙酮酸還原生成L-乳酸的關鍵酶，提高該酶的活力是乳酸工業(yè)菌種分子改造和提高乳酸產(chǎn)量的關鍵[3]。

利用重組DNA、代謝工程技術，有目的改變微生物中已有的代謝網(wǎng)絡和表達調控網(wǎng)絡是提高L-乳酸產(chǎn)量最有效的手段之一。通過過量表達ldh基因，在合適的宿主中高效表達來實現(xiàn)提高乳酸產(chǎn)量，楊登峰等[4]將Lactobacillus rhamnosus中的ldh基因轉入E.coli F中，成功實現(xiàn)基因的表達，并成功生產(chǎn)獲得純度為99%的L-乳酸；Ferain等[5]克隆出ldh基因，導入Lactobacillus plantarum DG301中過量表達LDH，酶活較初始菌株提高13倍。安徽工程大學發(fā)酵工程(安徽省)技術中心實驗室分離到一株干酪乳桿菌，以該菌株為出發(fā)菌，克隆出ldh基因，構建重組質粒pMG-ldh，將其轉入出發(fā)菌株中，篩選出陽性重組菌，過量表達乳酸脫氫酶，提高乳酸產(chǎn)量，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及試劑

干酪乳酸菌(L.casei) 安徽工程大學發(fā)酵工程(安徽省)技術中心實驗室分離；E.coli JM109、E.coli BL21(DE3) 生工生物工程(上海)股份有限公司；pMG36e 長沙贏潤生物技術有限公司。

pfu DNA聚合酶、連接酶、Marker、DNA回收試劑盒、基因組和質粒提取試劑盒等 生工生物工程(上海)股份有限公司；各種限制性內切酶 日本TaRaKa公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、果糖-1,6-二磷酸(FBP) 美國Sigma公司；其他試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳儀、電轉儀 美國Bio-Rad公司；PCR擴增儀 德國Eppendorf公司；高速臺式離心機 日本日立公司；液相色譜儀 美國Waters公司；SBA40-E生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25、玉米漿40、(NH4)2SO45、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、CaCO310，用于干酪乳桿菌培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，用于大腸桿菌培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂；MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40、酵母提取物5、蛋白胨10、牛肉膏10、CH3COONa·3H2O 5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.05、KH2PO41、C6H17N3O72、吐溫-80 1，用于干酪乳桿菌培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基加2g/100mL的瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120、酵母提取物7.5、蛋白胨15、牛肉膏10、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.05、吐溫-80 1、CaCO3100，調pH值為7.0。

1.4 方法

1.4.1 基因克隆

基因組DNA、質粒DNA的提取、酶切、連接、轉化和感受態(tài)細胞制備均參照文獻[6]，根據(jù)GenBank(M76708.1)中公布的干酪乳桿菌LDH基因序列，設計ldh基因的特異性引物P1(5’- GCTCTAGAGTGGCAAGTATTAC-3’)和P2(5’- AACTGCAGTTACTGACGGGTTT-3’)。PCR擴增條件為：94℃預變性3min；94℃變性1min，52℃退火30s，72℃延伸1min，25個循環(huán)。

1.4.2 干酪乳桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化

將斜面菌種接種于5mL的MRS培養(yǎng)基中，40℃、150r/min培養(yǎng)12h，按1%的接種量接入新鮮的50mL MRS培養(yǎng)基中，40℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4，無菌操作將50mL菌液冰上冰浴15min后，4℃、3000r/min離心5min，棄上清，用預冷的10%甘油充分懸浮菌體，4℃、3000r/min離心5min，棄上清，重復兩次；用400μL預冷的10%甘油重懸菌體，以每離心管100μL分裝，置于冰上備用。干酪乳桿菌電轉化法，參照文獻[7]方法。

1.4.3 重組質粒pMG-ldh的構建

PCR產(chǎn)物和載體pMG36e分別用XbaⅠ和PstⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，轉化到E.coli JM109感受態(tài)細胞中，涂布LB平板培養(yǎng)12h后挑單菌落至液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)10h，收集菌體，抽提質粒并雙酶切鑒定陽性克隆重組質粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.4 目的基因在干酪乳桿菌中表達

將構建好的重組質粒pMG-ldh電轉干酪乳桿菌感受態(tài)，以空質粒pMG36e做對照，均勻涂布含5μg/mL紅霉素的MRS平板上，40℃培養(yǎng)36～48h。挑取平板上的單菌落，接種于含5μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，抽提質粒進行雙酶切，確定重組菌L.casei pMG-ldh。

將含重組pMG-ldh的干酪乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、100r/min過夜培養(yǎng)，按1%的接種量接種新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期后期，收集菌體進行全細胞SDS-PAGE。

1.4.5 乳酸、丙酮酸的測定

樣品預處理方法：取適量發(fā)酵液8000r/min離心15min，取上清液，加入適量1mol/L硫酸溶液酸解12h后8000r/min離心15min，取上清液，過0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜后備用，標準品都為現(xiàn)配現(xiàn)用。

采用高效液相色譜法測定，檢測條件為：色譜柱為COSMOSIL5C18-PAQ(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為0.2mol/L KH2PO4溶液加1%的乙腈；調pH值至2.6～2.8；真空抽濾，流速1.0mL/min；檢測波長210nm；柱溫25℃；進樣量為10μL。

1.4.6 NADH的測定

樣品預處理方法：取10mL發(fā)酵液，8000r/min離心10min，棄上清液，收集菌體，迅速移入液氮中以阻斷微生物細胞代謝，解凍后再以預冷的緩沖液洗滌2～3次，超聲波破碎10min后8000r/min離心10min，上清液用0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜。

按Koning[8]和陳定強[9]等的方法測定，色譜分析條件為：色譜柱為COSMOSIL5C18-PAQ(4.6mm×250mm)；流動相為0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(含10%的乙腈和10mmol/L四丁基溴化銨)，調節(jié)pH 6.5，真空抽濾；流速1.0mL/min，檢測波長254nm；柱溫40℃；進樣10μL。

1.4.7 殘?zhí)菧y定

采用李憲民等[10]的測定方法，利用生物傳感器分析儀測定，取20μL發(fā)酵液上清液稀釋100倍，取20μL進樣測定。

1.4.8 細胞干質量測定

取適量發(fā)酵液，8000r/min離心5min，棄上清液，收集菌體，用1mol/L的HCl溶液洗滌除去CaCO3固體，重復2次，再用蒸餾水懸浮菌體放置烘箱中烘干，稱得菌體干質量(DCW)，確定DCW與菌體OD600nm值的對應關系。

1.4.9 乳酸脫氫酶活性測定

L-LDH酶活性分析參見文獻[11]，丙酮酸鈉和NADH分別用0.05mol/L乙酸緩沖液溶解，取2支比色皿，一支加入3mL丙酮酸鈉溶液作為空白對照，另一支3mL反應體系中依次加入2.9mL丙酮酸鈉溶液和0.1mL NADH溶液并混勻，檢測初始NADH吸光度，待穩(wěn)定后，迅速加入2μL酶液，開始光度計讀數(shù)，每15s測定一次吸光值，反應結束后得到ΔA340nm/min值，根據(jù)下述公式計算酶活力。酶活的定義為：在40℃、pH6.7時，每分鐘氧化1μmol的NADH所用的酶量為1個酶活力單位(U)。

式中：VT為反應總體積/mL；VS為樣品體積/mL；ΔA為每分鐘吸光度的降低值；b為比色皿光程/cm；ε為NADH消光系數(shù)(6.22×103L/(mol·cm))。

2 結果與分析

2.1 ldh基因克隆

以干酪乳桿菌基因組為模板，利用引物P1和P2進行PCR擴增獲得ldh基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示，泳道中1kb位置出現(xiàn)目的條帶，克隆的基因和目的基因大小一致。

圖 1 ldh基因的PCR電泳圖Fig.1 PCR amplification of ldh genes from L. casei

2.2 重組質粒pMG-ldhL的構建

PCR產(chǎn)物和質粒pMG36e經(jīng)XbaⅠ和PstⅠ雙酶切后，16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉化E.coli JM109，涂布LB平板培養(yǎng)12h，挑選單菌落液體培養(yǎng)，提質粒，經(jīng)雙酶切鑒定獲得陽性克隆質粒pMG-ldh，結果見圖2，泳道1中出現(xiàn)1000bp目的條帶，將pMG-ldh送上海生工測序，確定正確的閱讀框。

圖 2 重組質粒pMG-ldh的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMG-ldh by double enzyme digestion

2.3 ldh在干酪乳桿菌中的表達

空質粒pMG和重組質粒pMG-ldh分別電轉化至干酪乳桿菌感受態(tài)細胞中，分別將其接種于含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期后期收集菌體，進行全細胞SDS-PAGE電泳，結果如圖3，重組菌株經(jīng)培養(yǎng)后，與對照菌株相比，約在37kD處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，說明基因在干酪乳桿菌中高效表達。

圖 3 L.casei pMG-ldh在干酪乳桿菌中的表達Fig.3 SDS-PAGE analysis of PMG-ldh expression in L. casei

2.4 L.casei pMG-ldh搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

2.4.1 L.casei pMG-ldh與原始菌發(fā)酵過程中乳酸脫氫酶的變化

為了比較重組菌L.casei pMG-ldh和原始菌表達乳酸脫氫酶，進行了搖瓶發(fā)酵實驗，分別將重組菌和原始菌接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶，40℃、100r/min搖瓶培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵過程中LDH活性，結果如圖4所示，在發(fā)酵24h左右原始菌中LDH達到最大23U/mL，而重組菌L.casei pMG-ldh中酶活力達95U/mL，是原始菌的4.1倍。

圖 4 出發(fā)菌株和L.casei pMG-ldh發(fā)酵過程中酶活力的變化Fig.4 LDH activity of wild type and the recombinant L.casei strains

2.4.2 重組菌與原始菌的生產(chǎn)性能比較

從上述結果可知，重組菌過量表達了乳酸脫氫酶，為了進一步研究其產(chǎn)乳酸性能，進行了搖瓶發(fā)酵實驗，分別將重組菌和原始菌接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶，40℃、100r/min搖瓶培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵過程中發(fā)酵參數(shù)，結果如表1所示，雖然重組菌的LDH活性大幅度提高，但乳酸的產(chǎn)率并沒比原始菌有大幅度的提高，分別為1.98g/(L·h)和2.1g/(L·h)。通過分析發(fā)現(xiàn)，雖然重組菌的LDH活性高于原始菌，重組菌細胞內NADH和丙酮酸與原始菌相差不大，丙酮酸和NADH水平直接影響了其發(fā)酵性能。為了進一步提高其生產(chǎn)產(chǎn)量，分別添加4mmol/L激活劑果糖-1,6-二磷酸(FBP)和8mg/L NADH的前體物煙酸，結果發(fā)現(xiàn)往原始菌中添加激活劑和前體物煙酸，乳酸產(chǎn)量為105.6g/L，而L.casei pMG-ldh積累L-乳酸達128.2g/L，比原始菌提高了21.4%，原始菌在未添加激活劑和煙酸的條件下提高35%。重組菌在添加激活劑和煙酸的條件下生產(chǎn)強度達到3.04g/(L·h)，相比原始菌株L.casei提高53%。添加激活劑和煙酸后，葡萄糖消耗速度明顯加快，發(fā)酵到42h葡萄糖基本耗盡，發(fā)酵提前結束，發(fā)酵周期縮短了6h。

表 1 原始菌株和重組菌發(fā)酵過程參數(shù)比較Table 1 Fermentation parameters of wild type L.casei and the recombinant L.casei pMG-ldh strains

3 討 論

為了加強糖酵解速率以提高葡萄糖代謝速度，提高最終產(chǎn)物乳酸濃度，一種方法是通過過量表達關鍵酶或者改變營養(yǎng)環(huán)境條件提高EMP途徑磷酸果糖激酶等關鍵酶的酶活力[12-14]；另外可通過添加合成NAD+前體物、改變溶氧、溫度、過量表達NADH代謝相關酶等手段調節(jié)胞內能量水平、還原力水平來實現(xiàn)對NADH代謝的調控[15]，來實現(xiàn)乳酸產(chǎn)量的提高。

Porro等[16]將乳酸乳酸脫氫酶基因轉入野生型K.lactis酵母中過量表達乳酸脫氫酶，乳酸產(chǎn)量達109g/L，生產(chǎn)強度達0.91g/(L·h)，成功實現(xiàn)在外源宿主中實現(xiàn)乳酸脫氫酶的過量表達，并獲得較高的乳酸生產(chǎn)率。Saitoh等[17]將L-乳酸脫氫酶基因整合在釀酒酵母的染色體上，成功構建6個拷貝的重組酵母生產(chǎn)L-乳酸，產(chǎn)量達122g/L，且光學純度達到99.9%。這些現(xiàn)象說明增加乳酸脫氫酶基因拷貝數(shù)能夠提高乳酸的產(chǎn)量。本實驗室篩選到一株高產(chǎn)的乳酸菌，為進一步提高其生產(chǎn)應能，增加乳酸脫氫酶的基因拷貝數(shù)，將乳酸脫氫酶導入生產(chǎn)菌中實現(xiàn)高效表達。但是Ferain[5]、Davidson[18]等將乳酸脫氫酶導入到宿主Lactobacillus plantarum TF101中增加其拷貝數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)乳酸產(chǎn)量沒有大幅度的提高。這可能是由于糖代謝速率并沒有提高，增加基因的拷貝數(shù)的同時應該提高乳酸合成途徑的代謝通量。

本實驗以L.casei基因組為模板，PCR擴增得到ldhL基因，構建重組質粒pMG-ldhL，將重組質粒轉入L.casei，獲得重組菌L.casei pMG-ldh，培養(yǎng)重組菌表達目的蛋白，與對照初始菌株相比，約在37kD處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，酶活力有較大幅度的提高。在此基礎上，進一步考察激活劑和前體物煙酸對產(chǎn)酸的影響，結果發(fā)現(xiàn)具有高LDH活性的重組均產(chǎn)酸速率快，生產(chǎn)強度提高了53%，發(fā)酵周期縮短6h，乳酸積累達128.2g/L。通過表達乳酸脫氫酶以及改變乳酸脫氫酶的基因拷貝數(shù)，過調節(jié)乳酸脫氫酶的表達量和異源表達乳酸脫氫酶等手段可有效地改善了菌株合成乳酸的效率和所產(chǎn)乳酸的光學純度。胞內能量和還原力水平對微生物代謝的調控是相輔相成的，可通過調節(jié)胞內NADH的形式及濃度以及所產(chǎn)生的ATP 直接或間接調節(jié)代謝途徑中關鍵酶的活性，從而影響微生物細胞的生長及代謝功能，實現(xiàn)對碳代謝流及通量的調控，后續(xù)實驗還需要進一步深入研究細胞內LDH、ATP和還原力NADH對糖降解速率的影響，優(yōu)化最佳的代謝流控制途徑，進一步提高產(chǎn)量。

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