盧 彪，吳擁軍*，吳玉俊，羅 熹，劉艷敏

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

谷氨酰胺酶(glutaminase，GA，EC 3.5.1.2)廣泛存在于包括細(xì)菌、酵母菌、真菌等微生物中，具有γ-谷氨?；D(zhuǎn)移能力和谷氨酰胺水解活力。主要水解L-谷氨酰胺成L-谷氨酸和氨，在生物體氮代謝過(guò)程中扮演著重要作用，是谷氨酰胺分解的關(guān)鍵酶和限速酶[1-2]。將谷氨酰胺酶作為食品工業(yè)用酶己有100多年的歷史[3]。谷氨酸被認(rèn)為是醬、醬油等大豆發(fā)酵食品中主要的鮮味物質(zhì)[4]，而谷氨酸形成的鈉鹽谷氨酸鈉(味精)是目前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的增鮮調(diào)味品之一。經(jīng)調(diào)查貴州水豆豉生產(chǎn)企業(yè)得知，味精的使用成本約占總成本的25%～30%左右。如能通過(guò)安全方式將高活性的GA酶編碼基因整合至水豆豉主要發(fā)酵菌株枯草芽孢桿菌[5]中并表達(dá)其活性，將大量減少味精的添加量降低企業(yè)生產(chǎn)成本。

實(shí)驗(yàn)室前期已獲得豆豉生產(chǎn)菌株BJ3-2[5]，其GA酶活性較低；并從高谷氨酰胺酶活性的枯草芽孢桿菌株中克隆了glsA2基因[6]。本研究旨在通過(guò)驗(yàn)證glsA2在原核系統(tǒng)中表達(dá)GA酶的活力，為今后發(fā)酵生產(chǎn)和食品級(jí)改良置換BJ3-2的glsA1[6]基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株：E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒：pET-32a、pMD18-glsA2為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒 美國(guó)Omega公司；Bacterium Glutaminase Assay Kit 美國(guó)Genmed公司；Taq酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker等 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

MyLycler PCR儀、Universal Hood凝膠成像分析儀、Powerpac HC電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒pMD18-glsA2的提取[7]

將含有重組質(zhì)粒的pMD18-glsA2的E.coli DH5α接種于氨芐青霉素終質(zhì)量濃度為100μg/mL的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)。取2mL菌液使用質(zhì)粒小量試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提?。煌ㄟ^(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.2 表達(dá)載體pET32a-glsA2的構(gòu)建

1.3.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)glsA2基因序列及pET-32a的多克隆位點(diǎn)情況設(shè)計(jì)引物：Pga F：CGGGATCCATGCAGTGCATTGAAAC(BamHⅠ)，Pga R：CGGAATTCTTAGCTCCAACCTTCTTG(EcoRⅠ)[8]。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增[9]

glsA2基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL；反應(yīng)參數(shù)為：94℃、5min； 94℃、45s，52℃、40s，72℃、50s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min，4℃保存。

1.3.2.3 pET32a-glsA2的構(gòu)建

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。使用BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)回收產(chǎn)物及pET-32a進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物以T4 DNA連接酶連接[10]，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)[11]。通過(guò)菌落及質(zhì)粒PCR[12]并質(zhì)粒酶切鑒定[13]，獲得重組表達(dá)載體pET32a-glsA2。

1.3.2.4 重組表達(dá)載體在大腸桿菌中的優(yōu)化表達(dá)

陽(yáng)性重組子于5mL含100μg/mL氨芐青霉素的液體M9培養(yǎng)基[14-15]中，置37℃培養(yǎng)過(guò)夜，取50μL菌液加入50mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃、180r/min培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6[16]。加入終質(zhì)量濃度為0.5mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間分別為2、3、4、5、6、7、8、9h[17]。確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間后再設(shè)置0、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5mmol/L IPTG終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)[18]。

1.3.2.5 SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況[19-20]

取誘導(dǎo)后的菌液1mL，12000r/min離心去上清。沉淀懸于100μL SDS上樣緩沖液，100℃水浴3min后12000r/min離心取上清點(diǎn)樣進(jìn)行電泳。

1.3.2.6 重組菌株谷氨酰胺酶活力測(cè)定

最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件下對(duì)重組菌株利用細(xì)菌谷氨酰胺酶活性定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行酶活力檢測(cè)。谷氨酰胺酶單位活性定義為：在37℃、pH8.6條件下，每分鐘能夠轉(zhuǎn)化1μmol谷氨酰胺至谷氨酸所需的酶量作為一個(gè)活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增glsA2基因

圖 1 PCR擴(kuò)增glsA2基因Fig.1 PCR amplifi cation of glsA2 gene from pMD18-glsA2

由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得大小約924bp片段，與預(yù)期大小一致。

2.2 重組表達(dá)載體pET32a-glsA2質(zhì)粒PCR檢測(cè)及酶切結(jié)果

通過(guò)菌落PCR篩選得到的陽(yáng)性菌株后提取陽(yáng)性菌株的質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增glsA2基因，結(jié)果在924bp處出現(xiàn)一特異性條帶，所獲得的基因片段大小與glsA2基因大小相吻合，表明目的基因己與表達(dá)載體pET-32a發(fā)生了重組。

圖 2 重組質(zhì)粒pET32a-glsA2酶切鑒定Fig.2 Restriction digestion of recombinant plasmid pET32a-glsA2 with BamHⅠand EcoRⅠ

由圖2可知，通過(guò)限制性內(nèi)切酶對(duì)重組子pET32a-glsA2進(jìn)行雙酶切，酶切片段與預(yù)期大小一致，表明glsA2基因己插入表達(dá)載體pET-32a中，并成功發(fā)生了重組，即預(yù)期獲得重組表達(dá)載體pET32a-glsA2重組子。

2.3 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化

2.3.1 最佳誘導(dǎo)時(shí)間

圖 3 時(shí)間梯度誘導(dǎo)的SDS-PAGE分析Fig.3 Changes in time course of recombinant glutaminase expression in E. coli

將時(shí)間梯度誘導(dǎo)的陽(yáng)性重組子進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖3所示，陽(yáng)性重組子經(jīng)誘導(dǎo)后出現(xiàn)特異性目的蛋白條帶(箭頭所示位置)，而在同一位置的空載體未出現(xiàn)條帶(泳道C)；IPTG誘導(dǎo)時(shí)間為6h(箭頭所示)時(shí)蛋白表達(dá)量最高。

2.3.2 最佳IPTG誘導(dǎo)濃度

設(shè)置IPTG濃度梯度對(duì)重組子6h誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDSPAGE鑒定。由圖4可知，隨著IPTG濃度增加目的蛋白表達(dá)量也隨之增加，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.1mmol/L時(shí)，目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最大(箭頭所示條帶)，隨后IPTG濃度繼續(xù)增加目的蛋白的表達(dá)量反而有所降低。

圖 4 IPTG濃度梯度誘導(dǎo)的SDS-PAGE分析Fig.4 Expression of recombinant glutaminase induced at gradient concentrations of IPTG

2.4 重組pET32a-glsA2酶活力

在最優(yōu)誘導(dǎo)條件下對(duì)pET-32a、pET32a-glsA2谷氨酰胺酶活力進(jìn)行測(cè)定，兩株菌的酶活力分別為40.2、608.2U/μg。重組菌株pET32a-glsA2酶活力約為對(duì)照pET-32a/BL21的15倍。

3 討 論

通過(guò)構(gòu)建谷氨酰胺酶基因glsA2原核表達(dá)載體pET32aglsA2，并在E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)初步確定了其最佳誘導(dǎo)條件。對(duì)枯草芽孢桿菌來(lái)源的glsA2在大腸桿菌中高谷氨酰胺酶活性的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。

對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度進(jìn)行研究時(shí)，最初選用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。但在未添加IPTG時(shí)重組蛋白仍然表達(dá)，并在SDS-PAGE中出現(xiàn)明顯條帶。推測(cè)原因?yàn)長(zhǎng)B培養(yǎng)基組分中的胰蛋白胨或酵母提取物中含有乳糖或其類(lèi)似物，使其在未添加IPTG時(shí)仍能促使重組蛋白表達(dá)。后來(lái)改用成分清晰的M9培養(yǎng)基后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示在未添加IPTG誘導(dǎo)或添加終濃度小于0.01mmol/L時(shí)SDS-PAGE檢測(cè)不到重組蛋白條帶，從而證明推測(cè)結(jié)果正確。

對(duì)影響誘導(dǎo)表達(dá)的兩個(gè)關(guān)鍵因素(誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度)進(jìn)行了單因素優(yōu)化。其他因素如添加IPTG時(shí)的菌齡為OD600nm值為0.6及最適培養(yǎng)基等則是參考了pET表達(dá)手冊(cè)的方案，未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

谷氨酰胺酶基因glsA2是從高酶活枯草芽孢桿菌菌株GA317中克隆得到的，可用于食品級(jí)菌株的改良。實(shí)驗(yàn)對(duì)谷氨酰胺酶基因glsA2在E.coli BL21(DE3)中通過(guò)原核表達(dá)載體pET32a-glsA2進(jìn)行的酶活力表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。高酶活谷氨酰胺酶基因用于食品發(fā)酵微生物的改造尚未見(jiàn)報(bào)道，如果能實(shí)現(xiàn)食品級(jí)改良發(fā)酵菌株提高其產(chǎn)谷氨酸能力將在食品發(fā)酵行業(yè)具有較大應(yīng)用價(jià)值。

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