王 強(qiáng)，王春艷,2，胡 暉，劉紅芝，劉 麗

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

花生中蛋白質(zhì)含量高達(dá)26%～32%，是世界第三大蛋白質(zhì)來源?；ㄉ鞍缀腥梭w必需的8種氨基酸中，除蛋氨酸含量較低外，賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸含量均接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[1]，屬于完全蛋白。花生蛋白經(jīng)復(fù)合酶水解后，可制備出具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)活性的花生短肽?；ㄉ鞍踪|(zhì)酶解后粗產(chǎn)物一般是由蛋白質(zhì)、肽和氨基酸組成的混合物，可利用各種分離技術(shù)對其進(jìn)行分離純化而獲得高活性組分。功能性短肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其特定的生物活性存在密切聯(lián)系，肽分子鏈中氨基酸的組成、序列及分子構(gòu)象信息對其生物活性有著重要的影響。

在高活性花生短肽組分篩選與結(jié)構(gòu)表征方面，柳杰[2]通過發(fā)酵法制備了花生抗氧化肽，利用凝膠過濾、半制備RP-HPLC分離純化出4個(gè)組分，并確定了高抗氧化活性組分。Su等[3]利用微生物發(fā)酵法制備了花生短肽，經(jīng)RP-HPLC純化篩選出風(fēng)味肽，并表征了其氨基酸序列。在ACE抑制活性短肽構(gòu)效關(guān)系研究方面，Zaliani等[4]運(yùn)用主成分分析方法從36個(gè)參數(shù)中篩選出分子的立體與電性等特征參數(shù)，并對其ACE抑制活性進(jìn)行了研究。劉煥等[5]從肽鏈的一級結(jié)構(gòu)出發(fā)，以分子電邊矢量為參數(shù)，36種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶二肽抑制劑為樣本，構(gòu)建了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶二肽抑制劑的構(gòu)效關(guān)系模型。

綜上可見，相關(guān)研究多為高抗氧化活性花生短肽組分篩選，而高ACE抑制活性花生短肽組分分離純化與結(jié)構(gòu)表征卻鮮有報(bào)道，且短肽構(gòu)效關(guān)系研究多集中在短肽特別是二肽的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系方面，而花生短肽的構(gòu)象與ACE抑制活性的關(guān)系，即高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究卻較少。針對上述問題，本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC、MALDI-TOF-TOF MS鑒定了高活性ACE抑制肽的一級結(jié)構(gòu)，通過固相合成的方法合成相同序列的短肽，并進(jìn)一步驗(yàn)證了其ACE抑制活性；采用量子化學(xué)方法對短肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)與空間構(gòu)象進(jìn)行了分子模擬。本研究旨在明確高活性ACE抑制肽的氨基酸序列，揭示其高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)花生ACE抑制肽的功能化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及加工過程調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生分離蛋白為本實(shí)驗(yàn)室自制；Alcalase堿性蛋白酶 丹麥Novo公司；N120P蛋白酶 愛爾蘭凱利公司；ACE、馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL) 美國Sigma公司。

Sephadex G-15 美國Pharmacia 公司；乙腈(色譜純) 德國Merk公司；三氟乙酸(TFA) 美國Fluka公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHL-A電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器、微型旋渦混合儀、DH-5紫外檢測器 上海滬西分析儀器廠；GL-16G-II冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠；ProStar 218半制備RP-HPLC 美國Varian公司；Waters Breeze高效液相色譜儀 美國Waters公司；4700 Proteomics Analyzer質(zhì)譜儀 美國Framingham公司；Discovery Studio 3.5 Software 美國Accelrys公司。

1.3 方法

1.3.1 花生蛋白水解物的制備和分級

參考張宇昊等[6-7]方法對花生蛋白水解物進(jìn)行制備與分級。

1.3.2 ACE抑制活性的測定[8]

[8]方法進(jìn)行，ACE抑制率達(dá)到50%時(shí)的抑制劑質(zhì)量濃度即為半抑制質(zhì)量濃度，記為IC50。

1.3.3 Sephadex G-15分離純化ACE抑制肽

將處理好的Spehadex G-15裝柱(1.6cm×60cm)。稱取一定量的PP-Ⅲ凍干粉，溶于蒸餾水中，配成100mg/mL的溶液，取3mL溶液上柱，并用蒸餾水以0.3mL/min的流速洗脫，于220nm波長處檢測。洗脫組分分管收集，每管收集10min。重復(fù)上樣，合并每次分離時(shí)相同位置的組分峰，組分峰冷凍干燥。分別測定每個(gè)組分峰的ACE抑制IC50值，選出降血壓活性最強(qiáng)的組分PP-Ⅱ。

1.3.4 半制備RP-HPLC分離純化ACE抑制肽

HPLC系統(tǒng)：Varian Pro Star 218；色譜柱：Varian C18(21.2mm×150mm)；色譜條件：流速10mL/min，檢測波長214nm，進(jìn)樣量1mL，柱溫25℃；洗脫條件：0～50min，95%～70% A，5%～30% B (A：水+0.05% TFA；B：乙腈+0.05% TFA)。配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣，洗脫峰自動(dòng)收集后凍干。

1.3.5 質(zhì)輔助激光解吸電離MALDI-TOF-TOF MS測定短肽氨基酸序列

將1μL樣品溶液與1μL 5mg/mL基質(zhì)溶液(α-氰基-4-羥基肉桂酸溶于含0.1% TFA的50%乙腈中)混合，點(diǎn)于MALDI靶板上，待溶液干燥后進(jìn)行MALDI-TOF-TOF MS分析。質(zhì)譜條件：4700 Proteomics Analyzer質(zhì)譜儀(配4700 Explorer分析軟件，Applied Biosystems，USA)；激光源波長355nm，正離子模式檢測，頻率20Hz，加速電壓20kV。MS-MS用標(biāo)準(zhǔn)血纖維蛋白肽B進(jìn)行外標(biāo)校正，用4700 Explorer軟件自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。基質(zhì)和樣品的肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fi ngerprinting，PMF)質(zhì)量掃描范圍為600～1000D。一級MS掃描完成后，選擇所需的肽段離子進(jìn)行MS-MS分析，用DeNovo Explorer分析工具解析多肽的氨基酸序列。

1.3.6 短肽KLYMRP的合成

按照已鑒定出的一級序列，采用固相合成法合成短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro(KLYMRP)，樣品純度大于95%。

1.3.7 ACE抑制活性短肽量子化學(xué)計(jì)算方法

依照短肽P8的氨基酸序列(KLYMRP)構(gòu)建短肽鏈狀初始結(jié)構(gòu)。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化，主要步驟包括預(yù)處理、賦予立場、添加溶劑環(huán)境、升溫、平衡、采樣。

采用Discovery Studio軟件中的半柔性對接D S_CDOCKER這一模塊進(jìn)行分子對接。對接采用的受體分子-ACE來自于蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB(Protein Data Base)，代碼為1UZE(complex of the anti-hypertensive drug enalaprilat and the human testicular angiotensin Ⅰ-converting enzyme，人的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶與抗高血壓藥依那普利的復(fù)合物)，配體為經(jīng)過動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)化后的短肽分子KLYMRP，受體的活性位點(diǎn)通過對ACE配合物中抑制劑分子(依那普利-EAL3002)獲得。綜合對接結(jié)果進(jìn)行評估，判斷最穩(wěn)定復(fù)合物構(gòu)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 高ACE抑制活性花生短肽組分篩選

表 1 半制備RP-HPLC 分離純化花生肽PP-Ⅱ各組分ACE抑制率Table 1 ACE inhibitory activity of components in fraction PP-Ⅱ separated and purified by semi-preparative RP-HPLC

通過Sephadex G-15分離小于1kD的花生短肽，篩選出降血壓活性最強(qiáng)的組分PP-Ⅱ，其IC50值可達(dá)0.091mg/mL。將PP-Ⅱ經(jīng)RP-HPLC分離得到27個(gè)主要組分，由表1可知，各組分均有很強(qiáng)的ACE抑制活性，其中組分8(記作P8)ACE抑制活性最強(qiáng)，抑制率達(dá)85.77%。其次為組分3和組分11，ACE抑制率分別為66.79%和66.15%，因此選擇組分P8進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.2 MALDI-TOF-TOF MS解析ACE抑制肽的氨基酸序列

圖 1 短肽P8的MALDI MS-MS圖譜Fig.1 MALDI MS-MS spectrum of P8

對花生短肽P8進(jìn)行MALDI-TOF-TOF解析，母離子的碎裂離子經(jīng)二級質(zhì)譜分析得到MS-MS圖譜。由圖1可知，m/z 810.80的峰為分子離子峰[M+2H]2+，P8的相對分子質(zhì)量為808.80(理論相對分子質(zhì)量808.70)。利用軟件解析得到P8的氨基酸序列為Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro。對P8的ACE抑制活性進(jìn)行測定，得到IC50值為0.0052mg/mL(6.42μmol/L)。

2.3 合成短肽KLYMRP的ACE抑制活性驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證短肽KLYMRP的功能活性，采用固相合成方法合成了具有相同氨基酸序列的短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro，并對合成肽活性進(jìn)行測定，其ACE抑制IC50值為0.0038mg/mL(4.69μmol/L)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)此種氨基酸序列的短肽具有明顯的體外ACE抑制活性，且合成短肽的活性高于花生蛋白源短肽KLYMRP，原因可能是ACE抑制肽各氨基酸之間可形成多種不同構(gòu)象，肽鏈的空間構(gòu)象與其功能活性也存在一定的相關(guān)性。

目前已有從花生蛋白中分離出了不同的ACE抑制肽的報(bào)道，如黎觀紅等[9]利用堿性蛋白酶Alcalase對花生分離蛋白進(jìn)行水解，分別得到了Gln-Gly-Gly-Ser-Gly-Met-Thr-Leu-Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys和Lys-Ile-Phe-Leu-Arg-Leu-Ser 2種ACE抑制肽，其IC50值分別為10.60μmol/L和36.60μmol/L。也有研究者[10]分離純化出花生ACE抑制肽Tyr-Gly-Asn-Leu-Tyr，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.05mg/mL時(shí)，ACE抑制率達(dá)78.81%。此外利用乳酸菌發(fā)酵法從花生蛋白中分離純化出1種八肽Thr-Leu-Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys，其ACE抑制IC50值為23.30μg/mL[11]。Quist等[12]以胃蛋白酶和胰蛋白酶為工具酶先后酶解脫脂烘烤后花生粉，純化分離出序列為Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro的九肽，其IC50值為0.36μg/mL。Guang等[13]以Alcalase為工具酶制備花生ACE抑制肽，得到序列為Lys-Ala-Phe-Arg的短肽，其IC50值為16.90μg/mL。與上述ACE抑制肽相比，本實(shí)驗(yàn)中分離得到的花生肽KLYMRP具有較高的ACE抑制活性。

2.4 短肽KLYMRP氨基酸組成與ACE抑制活性關(guān)系

Eresha等[14]比較了部分ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，表明ACE底物或抑制劑的C末端三肽結(jié)構(gòu)對其與ACE的結(jié)合起著重要的影響，ACE傾向C末端三肽的每個(gè)位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制劑。當(dāng)C末端氨基酸為芳香族氨基酸(Trp、Tyr及Phe)和Pro，以及N末端為疏水性脂肪族支鏈氨基酸(Leu、Ile、Ala、Met)、芳香環(huán)氨基酸(Tyr、Phe、Try、Thy)和堿性氨基酸(Lys、Arg、His)時(shí)最有利于其與ACE的結(jié)合，但C末端若為二羧基氨基酸(如Glu)或Pro位于C末端倒數(shù)第2位和N末端時(shí)親和力將大大降低[15-19]。本實(shí)驗(yàn)中分離出的短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro的C末端為Pro，N末端為堿性氨基酸Lys，且肽的疏水性很強(qiáng)，符合上述規(guī)律，因此有利于與ACE活性部位的結(jié)合。

2.5 短肽KLYMRP構(gòu)象與ACE抑制活性的關(guān)系

短肽的生物活性除了與一級結(jié)構(gòu)氨基酸數(shù)量、種類和序列有關(guān)系之外，也與其構(gòu)象存在關(guān)系，但目前對于ACE抑制肽高級結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系研究尚不深入。本研究依據(jù)量子化學(xué)理論對ACE抑制肽的活性部位進(jìn)行了推測，初步探討了其ACE抑制活性與構(gòu)象的關(guān)系，以期為ACE抑制肽的功能化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供理論參考。

2.5.1 短肽KLYMRP構(gòu)象優(yōu)化

依照花生短肽P8的氨基酸序列(KLYMRP)構(gòu)建短肽鏈狀初始結(jié)構(gòu)。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化，搜索并分析其最低勢能構(gòu)象，即該短肽最穩(wěn)定的分子構(gòu)象，用于之后的分子對接環(huán)節(jié)。圖2為CHARMm立場下，400ps的動(dòng)力學(xué)模擬后短肽最穩(wěn)定分子構(gòu)象。

圖 2 短肽KLYMRP最穩(wěn)定分子構(gòu)象Fig.2 Most stable molecular conformation of KLYMRP

2.5.2 短肽KLYMRP與ACE之間的相互作用分析

圖 3 CDocker Energy最高的短肽KLYMRP-ACE復(fù)合物構(gòu)象Fig.3 Formation of KLYMRP-ACE complex with the highest CDocker energy score

ACE對血壓、電解質(zhì)和體液平衡、心血管系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)重塑起重要調(diào)節(jié)作用，短肽能夠與ACE作用從而達(dá)到調(diào)節(jié)血壓作用。將短肽KLYMRP作為配體分子置于受體分子ACE的活性位點(diǎn)，經(jīng)軟件計(jì)算后得分最高的短肽KLYMRP-ACE復(fù)合物構(gòu)象見圖3。

通過對KLYMRP與ACE相互作用的分析可知，Glu162、Asp358、Asp377及Arg522是ACE活性位點(diǎn)的關(guān)鍵組分，它們是負(fù)責(zé)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及結(jié)合強(qiáng)度的主要?dú)埢?表2)。短肽KLYMRP與ACE形成了5個(gè)氫鍵，包括短肽的O119原子和O120原子與ACE 522位的Arg形成氫鍵，短肽的H21原子、H22原子、H102原子分別與ACE 377位的Asp、162位的Glu、358位的Asp形成氫鍵(圖4)。綜合鍵長、鍵角的情況，Glu162、Asp377與短肽中H21原子、H22原子形成的氫鍵鍵長較短，鍵角較大，作用力較強(qiáng)(表3)，在KLYMRP與ACE的相互作用中起著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵作用。ACE 522位的Arg為其活性口袋的關(guān)鍵氨基酸，在配體與受體的結(jié)合中起著重要的作用[20]。短肽還與ACE357位的Trp成Pi-Cation相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定了相互作用關(guān)系。

圖 4 短肽KLYMRP與ACE相互作用細(xì)節(jié)圖Fig.4 Details of the ACE/KLYMRP interaction

表 2 短肽KLYMRP與ACE之間相互作用力Table 2 Interaction energy between the KLYMRP and ACE

表 3 短肽KLYMRP與ACE之間形成的鍵長和鍵角Table 3 Bond length and bond angle of hydrogen bonds observed between KLYMRP and ACE

ACE與鋅離子的相互作用可以抑制ACE的活性，在活性位點(diǎn)中起到極為重要的作用[21]。由圖5可知，短肽與ACE對接后，短肽中O64原子與O81原子與鋅離子之間的距離分別為2.17、2.29?，接近于氧原子(1.40?)與鋅離子(0.74?)的共價(jià)半徑總和(2.14 ?)[22-23]，表明短肽可以通過羰基與鋅離子形成配位鍵，連同His383、His387及Glu411這3個(gè)殘基一起與鋅離子結(jié)合。

圖 5 短肽KLYMRP、ACE與Zn2+相互作用細(xì)節(jié)圖Fig.5 Details of the KLYMRP/Zinc ion interaction at the ACE-active site

綜上分析可見，短肽KLYMRP與ACE活性位點(diǎn)的殘基形成5個(gè)氫鍵，一個(gè)Pi-Cation相互作用，并與鋅離子形成配位鍵，這些作用力共同穩(wěn)定了短肽-ACE復(fù)合物的構(gòu)象，從而有利于ACE抑制活性的發(fā)揮。

3 結(jié) 論

3.1 采用制備型RP-HPLC對經(jīng)超濾、凝膠過濾色譜分離得到的花生ACE抑制肽組分進(jìn)一步分離純化，主要得到27個(gè)組分，其中P8的ACE抑制活性最高，在0.010mg/mL質(zhì)量濃度條件下ACE抑制率達(dá)85.77%。

3.2 經(jīng)過MALDI-TOF-TOF MS序列分析，ACE抑制肽P8的相對分子質(zhì)量為808.80，氨基酸序列為Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro(KLYMRP)，其ACE抑制IC50值為0.0052mg/mL(6.42μmol/L)。通過固相合成的方法驗(yàn)證此ACE抑制肽的活性，得到合成肽KLYMRP的ACE抑制IC50值為0.0038mg/mL(4.69μmol/L)。

3.3 構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果表明，短肽KLYMRP的C末端為Pro，N末端為堿性氨基酸Lys，且肽的疏水性很強(qiáng)，有利于與ACE活性部位的結(jié)合。短肽KLYMRP與ACE活性位點(diǎn)的殘基形成五個(gè)氫鍵，短肽的O119原子和O120原子與ACE 522位的Arg形成氫鍵，短肽的H21原子、H22原子、H102原子分別與ACE 377位的Asp、162位的Glu、358位的Asp形成氫鍵。短肽KLYMRP與ACE357位的Trp形成Pi-Cation相互作用，并通過羰基與鋅離子形成配位鍵，連同His383、His387及Glu411這3個(gè)殘基一起與鋅離子結(jié)合，這些作用力共同穩(wěn)定了短肽-ACE復(fù)合物的構(gòu)象，有利于短肽ACE抑制活性的發(fā)揮。

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