郭慶啟，張 娜，姜元松，鄒傳山

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076)

天然功能食品不僅具有良好的抗氧化和清除自由基能力，而且對(duì)機(jī)體沒(méi)有任何毒副作用，已成為抗氧化活性物質(zhì)領(lǐng)域研究的新方向[1-2]。抗氧化肽是生物活性肽的一種，其特點(diǎn)是分子質(zhì)量小，易吸收[3]，在體內(nèi)能通過(guò)減少自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化而達(dá)到抗氧化和抗衰老的功能[4-5]。對(duì)比于目前廣泛使用的化學(xué)合成抗氧化劑，通過(guò)酶法、發(fā)酵法等生物技術(shù)從天然動(dòng)植物來(lái)源的蛋白質(zhì)中得到的抗氧化肽具有來(lái)源廣泛[6]、無(wú)毒副作用和抗氧化性質(zhì)較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。

作為世界四大堅(jiān)果之一的榛子，在我國(guó)東北地區(qū)具有豐富的資源，但榛子類保健食品在市場(chǎng)上并不多見(jiàn)，目前主要是對(duì)榛子仁進(jìn)行直接食用或制成榛子油、榛子粉等粗加工產(chǎn)品，并沒(méi)有進(jìn)行高附加值的精深產(chǎn)品開發(fā)。對(duì)于提取榛子油之后得到的榛子仁粕，其中的蛋白質(zhì)含量較高，是一種優(yōu)良的抗氧化肽的來(lái)源[9]，而目前僅作為飼料使用。本研究以榛子去油后的榛子仁粕為原料，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化Alcalase堿性蛋白酶水解榛仁蛋白質(zhì)的工藝條件，并對(duì)水解物的總還原能力和DPPH自由基清除能力進(jìn)行研究與比較，為榛子仁抗氧化肽的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

榛子(Corylus mandshurica)購(gòu)自伊春市五營(yíng)林業(yè)局，采集時(shí)間為2011年9月份，手工去殼后40℃條件下對(duì)流干燥。

Alcalase堿性蛋白酶 丹麥Novo Nordisk公司；DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；所用化學(xué)試劑均為分析純。

TU-1800SPC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；SHB-3循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；FW135型中藥粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；HA221-50-60型超臨界CO2萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；Kjeltec2300型定氮儀 瑞典Foss公司；44C2-A型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TGL-5離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 榛子仁的預(yù)處理

將榛子仁粉碎后過(guò)40目篩，采用超臨界CO2萃取方法對(duì)榛仁粉進(jìn)行脫脂處理，萃取溫度50℃，萃取壓力20MPa，萃取時(shí)間3h，測(cè)得去油后的榛子仁粕的蛋白質(zhì)含量為(76.72±0.14)%。

1.2.2 榛子仁粕蛋白酶解工藝的優(yōu)化

取3.0g榛子仁粕于三角瓶中，用一定比例的蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，?00℃條件下預(yù)處理30min后冷卻，按一定的酶與底物比加入Alcalase堿性蛋白酶，采用NaOH溶液和恒溫水浴保持體系的pH值和溫度恒定，水解一定時(shí)間后沸水浴滅酶，過(guò)濾，取濾液1mL定容至50mL進(jìn)行水解度的測(cè)定[10]。分別考察酶與底物比、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解pH值4個(gè)因素對(duì)水解度的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與分析。

將榛子仁粕在最佳酶解工藝條件下水解，3500r/min離心10min后取上清液真空冷凍干燥，取榛子粕蛋白酶解物進(jìn)行抗氧化能力的測(cè)定；同時(shí)配制不同質(zhì)量濃度的VC溶液，按下述方法進(jìn)行總還原能力和DPPH自由基清除能力的測(cè)定。

1.2.3 酶解物總還原能力的測(cè)定

準(zhǔn)確移取1.0mL樣液于試管中，分別加入2.5mL 0.2mol/L pH6.6磷酸緩沖液和2.5mL 1g/100mL鐵氰化鉀溶液，于50℃水浴中保溫20min，快速冷卻，再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液，4000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水、0.5mL 0.1g/100mL三氯化鐵溶液，充分振蕩，靜置10min后在700nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。取1.0mL 蒸餾水為空白對(duì)照液，同以上操作參比調(diào)零，以吸光度表示總還原能力的大小[11]。

1.2.4 酶解物DPPH自由基清除能力的測(cè)定

準(zhǔn)確移取1.0mL樣液于試管中，加入2.0mL 0.1mmol/L DPPH溶液振蕩搖勻，1.0mL蒸餾水與2.0mL 0.1mmol/L DPPH溶液混合作為空白對(duì)照，常溫避光反應(yīng)60min后在517nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，以蒸餾水參比調(diào)零[12]。DPPH自由基清除率見(jiàn)下式。

式中：A0為對(duì)照樣品的吸光度；A為樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alcalase堿性蛋白酶酶解條件的單因素試驗(yàn)研究

2.1.1 不同酶與底物比對(duì)水解度的影響

圖 1 不同酶與底物比對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme/substrate ratio on degree of hydrolysis

當(dāng)酶解液的pH值為8.0、酶解時(shí)間90min、酶解溫度50℃時(shí)，不同酶與底物比條件下的榛子仁粕的水解度，如圖1所示，隨著酶與底物比的增加，Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁粕蛋白質(zhì)的水解度一直呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)酶與底物比為4000U/g時(shí)，水解度為(14.37±0.08)%，然后水解度的增加趨于平緩。在酶解過(guò)程中，作為大分子的蛋白質(zhì)減少而生成小分子形式的肽，生成的肽作為蛋白酶的底物會(huì)進(jìn)一步的水解生成分子質(zhì)量更小的短肽，二者在酶解過(guò)程中存在著與蛋白酶的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用[13]。隨著酶用量即酶與底物比的增加，體系反應(yīng)的初速度很快，使得大部分的蛋白質(zhì)在較短的時(shí)間內(nèi)降解為肽，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)減少到一定程度時(shí)再增加酶的量，其與蛋白質(zhì)發(fā)生作用的幾率會(huì)大大降低，體現(xiàn)在水解度的增加趨于平緩，由于此時(shí)蛋白酶作用的底物主要是肽，因此水解肽也會(huì)引起水解度的緩慢上升，但其增幅已經(jīng)很小[14]，因此確定Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁蛋白的最適酶與底物比為4000U/g。

2.1.2 不同溫度對(duì)水解度的影響

圖 2 不同溫度對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of temperature on degree of hydrolysis

當(dāng)酶解液pH8.0、酶解時(shí)間90min、酶與底物比4000U/g時(shí)，不同溫度條件下的榛子仁粕的水解度，結(jié)果見(jiàn)圖2。蛋白酶分子穩(wěn)定性與酶解時(shí)的溫度是密切相關(guān)的，當(dāng)酶解溫度超過(guò)某一界限時(shí)，極易引起次級(jí)鍵的解離，從而使蛋白酶部分或完全失活，而酶解溫度低時(shí)，又會(huì)大大降低體系內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)的激烈程度，從而降低蛋白酶與底物的作用幾率[15]，因此蛋白酶水解時(shí)存在著其最適反應(yīng)溫度條件，由圖2可知，Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁粕蛋白的最適酶促反應(yīng)溫度為50℃。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

圖 3 不同酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

當(dāng)酶解液pH8.0、酶與底物比4000U/g、酶解溫度50℃時(shí)，不同酶解時(shí)間條件下的榛子仁粕的水解度，結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)分析了0～180min范圍內(nèi)的不同酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響趨勢(shì)，由圖可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度一直呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但90min后增加的趨勢(shì)趨于平緩，這可能是由于Alcalase本身為一種復(fù)合蛋白酶，其由內(nèi)切酶和端切酶所組成，在酶促反應(yīng)過(guò)程中，隨著內(nèi)切位點(diǎn)的減少使端切酶的活力開始有所體現(xiàn)，也表現(xiàn)為水解度的上升，但上升過(guò)程緩慢。

2.1.4 酶解pH值對(duì)水解度的影響

圖 4 酶解pH值對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of pH on degree of hydrolysis

當(dāng)酶解溫度50℃、酶解時(shí)間90min、酶與底物比4000U/g時(shí)，不同酶解pH值條件下的榛子仁粕的水解度，如圖4所示，酶解時(shí)pH值的變化對(duì)水解度的影響較顯著，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其最佳水解pH值為8.5，表明Alcalase復(fù)合酶更適合于在偏堿性的條件下發(fā)生水解作用。

2.2 Alcalase堿性蛋白酶酶解榛子仁蛋白工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及分析

由于酶解時(shí)間的變化對(duì)水解度影響較小，因此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶與底物比、酶解溫度和酶解pH值3個(gè)因素為變量，分別表示為x1、x2、x3，以水解度為響應(yīng)值[16]，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)因素水平編碼值。利用Design-Expert 7.0設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表1。

表 1 Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁蛋白的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental design and results for the response surface analysis to optimize the hydrolysis of hazelnut kernels with alcalase

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS9.1對(duì)表1中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，建立二次多元回歸方程如下：

水解度/%=－148.25425+0.002857x1+4.353x2+ 11.1815x3－4.08×10-7x12－4.075×10-5x1x2－0.05702x22+ 2.65×10-4x1x3+0.185x2x3－1.272x32

回歸分析與方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 響應(yīng)面模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表2可知，方程F值為25.46，表明模型因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸極顯著(P＜0.01)，失擬項(xiàng)顯著(P＜0.05)。該模型R2=97.04%，R2Adj=93.22%，說(shuō)明模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測(cè)[17]。

P水平是檢驗(yàn)編碼變量對(duì)水解度指標(biāo)的影響是否顯著，當(dāng)P＜0.05時(shí)表明變量影響顯著；當(dāng)P＜0.01時(shí)表明變量影響極顯著[18]；當(dāng)0.01＜P＜0.05時(shí)表明影響顯著。從表2可以看出，x1、x2、x1x2、x2x3、x12和x22項(xiàng)達(dá)到了顯著的水平，其中酶與底物比和酶解溫度、酶解溫度和水解pH值間存在著交互作用，具體交互作用如圖5所示。

圖 5 酶與底物比、酶解溫度和酶解pH值交互作用影響水解度的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots indicating the effects of three hydrolysis parameters on degree of hydrolysis

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果為：酶與底物比3720U/g、酶解溫度50.6℃、酶解pH 8.4，最大水解度預(yù)測(cè)值為14.41%；在此工藝條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到水解度的實(shí)測(cè)值為(14.38±0.06)%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)值與回歸方程的預(yù)測(cè)值之間吻合程度很高。

2.4 酶解物的總還原能力

由圖6可知，無(wú)論是榛子仁蛋白酶解物還是VC，隨著質(zhì)量濃度的增加其總還原能力均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。相同質(zhì)量濃度條件下，雖然榛子仁蛋白酶解物的總還原能力要低于VC，但已表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，其總還原能力約為VC的70%，是一種優(yōu)良的植物源天然抗氧化劑。

圖 6 榛子仁蛋白酶解物和VC的總還原能力Fig.6 Comparison of total reducing power between hazelnut kernel hydrolysate and VC

2.5 酶解物的DPPH自由基清除能力

圖 7 榛子仁蛋白酶解物(a)和VC(b)對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.7 Comparison of DPPH radical scavenging effect between hazel protein enzyme hydrolysate (a) and VC (b)

DPPH是一種有機(jī)自由基，物質(zhì)對(duì)于DPPH自由基的清除效果是目前被作為其是否具有抗氧化能力的重要指標(biāo)之一[19]。不同質(zhì)量濃度條件下的VC和榛子仁蛋白酶解物的DPPH自由基清除效果，如圖7所示，隨著VC和酶解物質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH自由基的效果增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，通過(guò)質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率之間的線性關(guān)系[20]，計(jì)算出VC對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為0.0053mg/mL，榛子仁蛋白酶解物的IC50為0.7311mg/mL。盡管榛子仁蛋白酶解物具有清除DPPH自由基的效果，但當(dāng)其達(dá)到與VC相同的清除能力時(shí)，需要其質(zhì)量濃度約為VC質(zhì)量濃度的138倍，可見(jiàn)榛子仁蛋白酶解物對(duì)于DPPH自由基的清除能力要明顯的低于VC的清除效果。

3 結(jié) 論

3.1 通過(guò)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)得到Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁粕的數(shù)學(xué)模型，經(jīng)SAS軟件分析，該模型能夠較好的模擬Alcalase堿性蛋白酶酶解制備榛子仁蛋白肽的過(guò)程，最佳水解工藝參數(shù)為：酶與底物比3720U/g、酶解溫度50.6℃、酶解pH8.4，此工藝條件下的水解度預(yù)測(cè)值為14.41%，水解度實(shí)測(cè)值為(14.38±0.06)%。

3.2 榛子仁蛋白酶解物的抗氧化能力測(cè)定結(jié)果表明：與VC相比，酶解物的總還原能力較強(qiáng)，且抗氧化能力與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；但DPPH自由基的清除能力較弱，相同清除能力時(shí)，酶解物的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度約為VC質(zhì)量濃度的138倍。

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