張建萍，劉恩岐*，巫永華，陳尚龍

(徐州工程學院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221008)

生姜蛋白酶是繼木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶等之后發(fā)現(xiàn)的一種新的植物蛋白酶，在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上與上述蛋白酶具有很多相似性，被認為是木瓜蛋白酶家族的又一新成員。但由于穩(wěn)定性差、失活快，限制了其在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用[1]。酶分子的化學修飾是指在分子水平上改造酶蛋白，將酶蛋白的側(cè)鏈基團與一些化學基團特別是具有生物相容性的大分子進行共價連接，從而改變其酶學性質(zhì)，以提高酶活力、增強穩(wěn)定性[2]。右旋糖苷是一種天然的大分子多糖，它由D-葡萄糖通過α-1,6糖苷鍵連接而成，具有良好的生物相容性和水溶性，其糖鏈上的醛基經(jīng)活化后可與酶蛋白分子上的游離氨基共價結(jié)合[3-4]，是目前應(yīng)用廣泛的酶分子及蛋白質(zhì)修飾劑之一。已有報道用于修飾堿性蛋白酶[5]、脂肪酶[6]、胭脂魚胰蛋白酶[7]、Savinase蛋白酶[8]以及花生蛋白[9]等，并取得了較好的修飾效果。本實驗在生姜蛋白酶分離純化的基礎(chǔ)上，以高碘酸鈉活化的右旋糖苷對生姜蛋白酶進行化學修飾，研究化學修飾反應(yīng)的最佳條件、修飾效果以及修飾前后的酶學性質(zhì)變化，為生姜蛋白酶的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮生姜 徐州農(nóng)貿(mào)市場；右旋糖苷(dextran40000) 日本和光純業(yè)工業(yè)株式會社；高碘酸鈉 天津基準化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、亞硫酸氫鈉、硼氫化鈉、碳酸氫鈉、三氯乙酸、十二烷基磺酸鈉(SDS) 國藥集團化學試劑有限公司；Sephadex G-50、二乙氨基乙基纖維素DE-52、三聚氯氰(C3Cl3N3)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；THZ-82型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械廠；IT-09A-5型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海一恒科學儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Alphal-2LDPLUS型真空冷凍干燥機 德國Christ公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國安瑪西亞公司；Sigma3K30高速冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜蛋白酶的制備

將1kg洗凈的新鮮生姜切丁，加入2L經(jīng)4℃預冷的磷酸緩沖液(pH6.0、0.05mol/L)，用高速組織搗碎機制成勻漿，4000r/min離心20min，棄渣取上清液。將姜液與4℃預冷的丙酮按體積比1：1混合，12000r/min離心5min，棄上清液，取沉淀真空冷凍干燥，制得生姜蛋白酶粗粉[10]。將生姜蛋白酶粗粉用pH6.0磷酸緩沖液溶解后，采用蛋白純化系統(tǒng)經(jīng)Sephadex G-50和二乙氨基乙基纖維素DE-52分離純化，透析脫鹽后經(jīng)冷凍干燥得到生姜蛋白酶純品[11]。

1.3.2 生姜蛋白酶活力測定

酶活定義為在50℃、pH6.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個蛋白酶活力單位，按宋琦[12]報道的方法測定生姜蛋白酶修飾前后的酶活力(U/mg)，按照式(1)計算修飾酶的相對酶活力。

1.3.3 右旋糖苷的活化及其對生姜蛋白酶的修飾

取1g右旋糖苷溶于10mL蒸餾水，加入1mL質(zhì)量濃度為12g/L的NaIO4溶液，于4℃反應(yīng)18h，再加入質(zhì)量濃度為5g/L的NaHSO3溶液還原過量的NaIO4，室溫下以蒸餾水透析4h后，再以5L磷酸緩沖液(pH6.0、0.05mol/L)透析16h，濃縮、凍干即得活化右旋糖苷[6,13]。

將活化右旋糖苷以一定的比例加入生姜蛋白酶質(zhì)量濃度為2mg/mL的磷酸緩沖液中，同時按質(zhì)量濃度為1mg/L加入酪蛋白底物(修飾過程加入底物保護酶活性部位可以提高修飾酶的活性)[14]，在一定的條件下進行修飾反應(yīng)，然后加入質(zhì)量濃度為50mg/mL的NaBH4溶液終止反應(yīng)，調(diào)pH值至7.0用蒸餾水透析4h，濃縮、凍干即得修飾的生姜蛋白酶[15]。通過測定相對酶活力和酶蛋白氨基修飾率，研究活化右旋糖苷對生姜蛋白酶的最佳修飾條件。

1.3.4 酶蛋白氨基修飾率的測定

采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法[16]測定酶蛋白氨基修飾率。酶蛋白表面的游離氨基與過量的TNBS反應(yīng)，生成三硝基苯酚的衍生物，在335nm波長處有最大吸收峰，根據(jù)這一原理可以檢測出蛋白質(zhì)表面殘留的氨基。取質(zhì)量濃度為1mg/mL的生姜蛋白酶液1mL，加入1mL質(zhì)量濃度為4g/L、pH 8.5的碳酸氫鈉溶液和1mL質(zhì)量濃度為10g/L的SDS溶液，20min后加入1mL質(zhì)量濃度為0.1g/L的TNBS溶液，40℃保溫2h，再加入1mol/L的鹽酸0.5mL終止反應(yīng)。335nm波長處測定吸光度。同樣質(zhì)量濃度的酶液在修飾反應(yīng)后與反應(yīng)前吸光度之比即為殘留氨基量，按公式(2)計算生姜蛋白酶的氨基修飾率。

式中：A1為酶液修飾反應(yīng)前吸光度；A2為酶液修飾反應(yīng)后的吸光度。

1.3.5 生姜蛋白酶的酶學性質(zhì)測定

以質(zhì)量濃度為1g/L的酪蛋白為底物，測定不同溫度和pH值條件下天然酶和修飾酶的酶活力(U/mg)，分析比較生姜蛋白酶修飾前后的最適溫度、最適pH值。

將修飾前后的生姜蛋白酶和底物溶液在80℃保溫一定時間，冷卻至50℃，迅速測定其酶活性，計算殘留酶活力。

在最適反應(yīng)溫度和pH值條件下，以酪蛋白為底物，測定酪蛋白不同質(zhì)量濃度[S] (2～1000μg/mL)條件下，生姜蛋白酶天然酶和修飾酶催化水解酪蛋白的反應(yīng)速率V(亦即酶活力)，以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標，以反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，推導出反應(yīng)速率與底物質(zhì)量濃度的關(guān)系式即米氏方程式，求出其酶動力學特征參數(shù)：米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)[17]。

1.3.6 紫外吸收光譜測定[18]

以pH6.0、0.05mol/L磷酸緩沖液配制生姜蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25mg/mL，測定其修飾前后的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 pH值對修飾效果的影響

在溫度35℃，生姜蛋白酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：14，pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0條件下修飾3h，終止反應(yīng)，測其修飾前后的酶活力和氨基殘留量，計算相對酶活力和氨基修飾率，結(jié)果見圖1。pH 6.0時相對酶活力和修飾率都達到最大，這一結(jié)果與伍志權(quán)等[18]用右旋糖苷修飾酵母蔗糖酶的研究報道基本一致，因此選擇pH5.5～6.5進一步正交試驗。

圖 1 pH值對活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of modifi ed zingibain

2.1.2 溫度對修飾效果的影響

在pH6.0，生姜蛋白酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：14，溫度分別為25、30、35、40、45℃條件下修飾3h，終止反應(yīng)，測定計算其相對酶活力和氨基修飾率，結(jié)果見圖2。溫度小于40℃時，修飾酶的相對酶活力和修飾率隨著溫度升高而升高，之后又開始下降，選擇修飾反應(yīng)溫度38～42℃進一步正交試驗。

圖2 溫度對活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of modifi ed zingibain

2.1.3 活化右旋糖苷用量對修飾效果的影響

圖 3 酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比對右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的影響Fig.3 Effect of mass ratio of zingibain to activated dextran on the activity of modifi ed zingibain

在pH6.0，溫度40℃，生姜蛋白酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比分別為1：7、1：14、1：21、1：28、1：35的條件下修飾3h，終止反應(yīng)，測定計算其相對酶活力和氨基修飾率，結(jié)果見圖3。隨著活化右旋糖苷用量的增加，修飾率不斷上升，相對酶活力則在酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：21時達到最高，之后又開始下降。因此，選擇酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：20～1：22進一步正交試驗。

2.1.4 修飾時間對修飾效果的影響

在溫度35℃、pH7.0，生姜蛋白酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：14的修飾反應(yīng)條件下，分別修飾0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h，終止反應(yīng)，測定計算其相對酶活力和氨基修飾率，結(jié)果見圖4。隨著修飾時間的延長，相對酶活力和氨基修飾率都逐漸升高，修飾時間為3h時達到最高，之后開始下降，這可能是因為修飾時間過短，修飾劑與酶未能充分結(jié)合；修飾時間過長，修飾反應(yīng)中間產(chǎn)物—吡氯芐氧胺不穩(wěn)定分解所致[14,18]，因此選擇修飾時間為2.8～3.2h進行進一步正交試驗。

圖 4 修飾時間對活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的影響Fig.4 Effect of modifi cation time on the activity of modifi ed zingibain

2.2 活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行L9(34)正交試驗，其設(shè)計方案及結(jié)果見表1，由極差分析可知，以相對酶活為修飾效果指標時，各因素的主次順序是：修飾時間＞酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比＞pH值＞溫度，理論最佳方案為A2B2C3D3；對理論最佳方案進行驗證實驗，結(jié)果修飾酶的酶活力為291.5U/mg，氨基修飾率為57.8%，與修飾前生姜蛋白酶(酶活力96.2U/mg)相比的相對酶活力為303.2%，即修飾酶活力約是天然生姜蛋白酶的3.0倍，優(yōu)于試驗最佳方案。以修飾率為評價指標時，各因素的主次順序為：修飾時間＞酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比＞pH值＞溫度，理論最佳方案為A3B2C2D3；對理論最佳方案進行驗證實驗，結(jié)果氨基修飾率為75.8%，修飾酶的酶活力為182.8U/mg，約是天然生姜蛋白酶的1.9倍。試驗結(jié)果表明，修飾條件各因素對修飾酶活性和修飾率影響的主次順序一致，但酶蛋白氨基修飾率最高時修飾酶活力反而有所降低，這是由于水溶性大分子對酶蛋白的修飾是隨機的，盡管在底物保護下酶的活性中心不被破壞，但這種隨機修飾極有可能修飾到酶活性中心附近或用以維持酶活性天然構(gòu)象的有關(guān)氨基，從而導致酶活性下降[19]。綜合比較，確定右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的較佳方案為A2B2C3D3，即修飾時間3h、pH6.0、溫度42℃，酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比為1：22。

表 1 活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Factors and levels of the orthogonal array design L9(34)

表 2 正交試驗方差分析Table 2 Orthogonal array design matrix L9(34) and experimental results

將極差分析對修飾酶相對酶活和氨基修飾率影響最小的C因素(溫度)作為誤差的估計值進行方差分析，結(jié)果見表2，以相對酶活為修飾效果指標時，A因素(修飾時間)具有顯著影響(P＜0.05)，B因素(pH值)和D因素(酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比)對結(jié)果均無顯著影響(P＞0.05)；以氨基修飾率為評價指標時，修飾時間、pH值和酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比各因素對試驗結(jié)果均無顯著影響(P＞0.05)。單從該方差分析結(jié)果來看，修飾時間是唯一對修飾酶的活性具有顯著性影響的因素，修飾時間不足，酶蛋白分子氨基修飾率低，達不到降低酶催化反應(yīng)所需要的化學能從而提高酶活力的效果，修飾過度，有可能修飾到酶活性中心附近用以維持酶活性天然構(gòu)象的有關(guān)氨基，反而降低修飾酶的活性。而從正交試驗設(shè)計方案層面進一步分析，之所以只有修飾時間為重要影響因素，其他因素的F值均不顯著，是因為這種無重復試驗的方差分析的誤差是由影響最小的因素一列或空列來估計的，誤差自由度過小，誤差平方和較大，致使各因素的效應(yīng)達不到顯著水平，所以擬按正交試驗設(shè)計表再設(shè)置幾次重復，進行進一步的試驗，通過有重復試驗的方差分析，提高分析的靈敏度，試驗確定其他因素對修飾酶活性的重要影響程度[20]。

本病主要發(fā)生于雙月齡前后15日齡左右的仔豬，尤以生長快、肥胖的仔豬較易發(fā)生。小至數(shù)日齡、大至4月齡也偶有發(fā)生。一年四季均可發(fā)生，但以3～5月和9～11月多發(fā)，常呈散發(fā)性流行，多在氣候驟變和陰雨季節(jié)發(fā)病，傳染源主要是帶菌母豬和仔豬，常發(fā)病突然，死亡率高。

2.3 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶學性質(zhì)比較

2.3.1 最適溫度

圖 5 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶最適反應(yīng)溫度的比較Fig.5 Comparison of optimum temperature between modifi ed and natural zingibain

由圖5可知，以酪蛋白為底物時，天然生姜蛋白酶的最適溫度為55℃，經(jīng)過活化右旋糖苷修飾后的修飾酶的最適溫度為50℃。這可能是因為化學修飾通過改變酶的構(gòu)象而降低了酶催化反應(yīng)所需要的化學能，因此表現(xiàn)為酶的最適溫度有所下降[16,18]。

2.3.2 最適反應(yīng)pH值

圖 6 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶最適反應(yīng)pH值的比較 Fig.6 Comparison of optimum pH between modifi ed and natural zingibain

由圖6可知，以酪蛋白為底物時，天然生姜蛋白酶的最適pH值為6.0，經(jīng)過活化右旋糖苷修飾后的修飾酶的最適pH值為5.0～5.5。這可能是由于右旋糖苷修飾了酶表面的堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基[16,18]，右旋糖苷的引入影響了酶分子的電荷分布，從而影響酶的最適pH值。

2.3.3 熱穩(wěn)定性比較

將修飾前后的生姜蛋白酶和底物溶液在80℃保溫一定時間，然后測定不同熱處理時間的殘留酶活力，結(jié)果見圖7。隨著熱處理時間的延長，天然生姜蛋白酶和修飾酶的酶活力均呈下降趨勢，但修飾酶的活力下降幅度較小，保溫60min后天然生姜蛋白酶與修飾酶的殘留酶活力分別為35.1%和61.8%；保溫80min后天然生姜蛋白酶與修飾酶的殘留酶活力分別為19.1%和47.2%。說明修飾酶的熱穩(wěn)定性比天然生姜蛋白酶明顯提高，這可能是因為酶與修飾劑交聯(lián)后，使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，減少了酶分子內(nèi)部基團的熱振動，從而增強了酶的熱穩(wěn)定性[19]。

圖 7 60℃條件下生姜蛋白酶修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較 Fig.7 Comparison of heat stability at 60 ℃ between modifi ed and natural zingibain

2.3.4 生姜蛋白酶修飾酶和天然酶的動力學參數(shù)比較

圖 8 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶對底物的Km比較Fig.8 Comparison of Km between modifi ed and natural zingibain

由圖8可知，生姜蛋白酶天然酶和修飾酶的Km值分別為0.21μg/mL和0.14μg/mL，天然酶的Km值是修飾酶1.5倍，天然酶和修飾酶的最大反應(yīng)速率分別為17.54μg/(min·mL)和35.84μg/(min·mL)。這可能是因為活化右旋糖苷對生姜蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)或其反應(yīng)環(huán)境有所改變，從而增加了底物與生姜蛋白酶的親和力，其機理有待進一步研究。

2.3.5 紫外吸收光譜分析

由圖9可知，在pH6.0、0.05mol/L 磷酸緩沖液中，天然生姜蛋白酶的紫外吸收光譜有2個明顯的吸收峰，吸收波長分別為219nm和273nm。與天然生姜蛋白酶相比，修飾酶在200～250nm處吸收波長向長波長方向偏移6nm，其機理可能是右旋糖苷的引入改變了酶分子的微環(huán)境，使分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)趨于松散，n和π*軌道間的能量差減小，引起吸收峰向長波長方向偏移[21]。修飾酶在270～280nm波長處沒有明顯吸收峰，進一步說明修飾酶的構(gòu)型構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖 9 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶的紫外吸收光譜Fig.9 Ultraviolet absorption spectra of modifi ed and natural zingibain

3 結(jié)論與討論

相關(guān)研究報道表明[14,16,18,22]，修飾時間越長，反應(yīng)越徹底，但修飾時間過長，可能導致本來不太穩(wěn)定的中間產(chǎn)物分解，同樣不利于修飾反應(yīng)的進行；修飾劑用量會影響酶蛋白氨基修飾率和修飾酶的性質(zhì)，修飾劑用量增大，修飾程度加大，酶表面偶聯(lián)的大分子修飾劑形成空間位阻效應(yīng)，使底物不易與酶活性位點接近和相互作用而致使酶活性下降，氨基修飾率過高，修飾酶活性反而降低；一般情況下，提高pH值可以提高修飾反應(yīng)速率，但右旋糖苷分子上的醛基(與酶蛋白側(cè)鏈氨基共價結(jié)合得到修飾酶)在堿性條件下不穩(wěn)定，會發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)，致使修飾率下降，進而影響修飾酶活性；修飾反應(yīng)溫度越高，反應(yīng)速率越大，但酶分子結(jié)構(gòu)由于各基團在高溫下的熱運動而趨于松散，容易出現(xiàn)修飾過度、酶蛋白變性等情況，最終導致修飾酶活性降低。

本實驗采用NaIO4活化的右旋糖苷對生姜蛋白酶進行化學修飾，結(jié)果顯示，修飾反應(yīng)溫度、pH值、酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比和修飾時間對酶蛋白氨基修飾率和修飾酶的活性都有較大影響，且修飾率在一定范圍內(nèi)與修飾酶活力呈正比關(guān)系，但修飾率最高時修飾酶活力反而降低，試驗確定的較佳修飾反應(yīng)條件為溫度42℃、pH6.0、酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比1：22、修飾時間3h。與天然生姜蛋白酶相比較，修飾酶的相對酶活力提高了2.0倍，酶蛋白氨基修飾率為57.8%。以酪蛋白為底物時，修飾酶的最適溫度、最適pH值和Km值(酶促反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率50%所對應(yīng)的底物濃度)較天然生姜蛋白酶均有所降低，表明通過活化右旋糖苷修飾酶蛋白分子能夠降低酶催化反應(yīng)所需要的化學能，提高生姜蛋白酶對底物的親和力，從而提高修飾酶的活性。修飾酶的熱穩(wěn)定性比天然生姜蛋白酶明顯增強，80℃熱處理80min后生姜蛋白酶天然酶與修飾酶的殘留酶活力分別為19.1%和47.2%；紫外吸收光譜測定顯示，修飾酶在200～250nm波長處吸收波長向長波長方向偏移6nm，可能是酶與修飾劑交聯(lián)后構(gòu)型構(gòu)象發(fā)生改變，增強了熱穩(wěn)定性，其機理有待進一步研究。

[1] 代景泉. 生姜蛋白酶的分離純化及其部分特性的研究[D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學, 2008.

[2] 王金勝. 酶工程[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2007, 141.

[3] NAKAMURA S, KATO A, KOBAYASHI K. New antimicrobial characteristics of lysozyme-dextran conjugate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1991, 39(4)： 647-650.

[4] MATEO C, PALOMO J M, van LANGEN L M, et al. A new, mild cross-linking methodology to prepare cross-linked enzyme aggregates[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 86(3)： 273-276.

[5] YAMAGATA Y, ARAKAWA K, YAMAGUCHI M, et al. Functional changes of dextran-modified alkaline proteinase from alkalophilic Bacillus sp.[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1994, 16(2)： 99-103.

[6] CASA R M, GUISAN J M, SANCHEZ-MONTERO J M, et al. Modifi cation of the activities of two different lipases from Candida rugosa with dextrans[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 30： 30-40.

[7] 李秀娟. 胭脂魚胰蛋白酶的分離純化與化學修飾研究[D]. 重慶： 重慶師范大學, 2010.

[8] 朱怡然. 右旋糖酐修飾Savinase蛋白酶及用于羊毛防氈縮整理[D]. 無錫： 江南大學, 2012.

[9] LIU Yan, ZHAO Guanli, ZHAO Mouming, et al. Improvement of functional properties of peanut protein isolate by conjugation with dextran through Maillard reaction[J]. Food Chemistry, 2012, 131： 901-906.

[10] 唐曉珍, 黃雪松, 喬聚林, 等. 生姜蛋白酶的工業(yè)提取方法比較[J]. 無錫輕工大學學報, 2003, 22(2)： 18-21.

[11] 杜新永, 唐曉珍. Sephadex G-50純化生姜蛋白酶的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(3)： 303-305.

[12] 宋琦. 生姜蛋白酶酶活測定方法的研究[J]. 食品科技, 2010, 35(1)： 277-281.

[13] ELAHI H K, 吳梧桐, 劉景晶, 等. 右旋糖苷對大腸桿菌L-天門冬酰胺酶Ⅱ的化學修飾[J]. 藥物生物技術(shù), 1997, 4(4)： 208-211.

[14] 黎春怡, 黃卓烈. 化學修飾法在酶分子改造中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報, 2011(9)： 39-43.

[15] 羅瑤, 古志平. 右旋糖苷對超氧化物歧化酶的化學修飾及性質(zhì)研究[J]. 廣州食品工業(yè)科技, 1998, 14(2)： 20-22.

[16] 伍志權(quán). 右旋糖苷修飾酵母蔗糖酶的研究[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學, 2008.

[17] 付一帆, 周宇, 李星鑫, 等.香蔥中蒜氨酸酶的分離純化及其酶學性質(zhì)[J]. 食品科學, 2012, 33(5)： 129-133.

[18] 伍志權(quán), 黎春怡, 麥小珊, 等. 右旋糖苷修飾酵母蔗糖酶條件的篩選及修飾酶性質(zhì)的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報, 2009, 30(4)： 48-52.

[19] 舒薇, 賀麗蘋, 崔堂兵, 等. 聚乙二醇修飾對木瓜凝乳蛋白酶酶學及藥物生物學性質(zhì)的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報, 2006, 27(1)： 65-68.

[20] 王欽德, 楊堅. 食品試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2003： 357-359.

[21] 高向陽. 新編儀器分析[M]. 北京： 科學出版社, 2004： 16-17

[22] 易喻. 蚓激酶分子修飾的研究[D]. 杭州： 浙江工業(yè)大學, 2004.