李 華，劉恩岐,，唐仕榮，巫永華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008)

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)[1-3]，通過對蛋白質(zhì)適當(dāng)酶解可得到具有各種生物活性的功能肽，其中研究報道最多的是抗氧化肽，多肽在原蛋白序列中并無活性，一般通過胃腸道消化時釋放出來的很少，但通過體外定向酶解并加以分離純化，得到的肽段具有與天然活性肽類似或相同的功能。黑豆是種皮為黑色的大豆，屬于高蛋白低脂肪類型大豆，通過酶法水解與分離純化制備抗氧化黑豆肽類產(chǎn)品，盡管活性稍低，但價廉易得，易于吸收，安全性高，具有良好的開發(fā)前景[4-5]。蛋白質(zhì)水解過程中，因肽鍵的斷裂，氨基和羧基發(fā)生質(zhì)子交換，溶液pH值會自動下降，采用單一的酶制劑水解過程中一般都要外加堿液來維持水解液的pH值以確保酶的最佳活性，增加了水解物下游處理過程的脫鹽除雜難度。在沒有外加堿的pH值漸變條件下，采用多酶組合分步水解有利于產(chǎn)品的后期分離精制和提高產(chǎn)品純度，并且由于不同酶在底物上的作用位點(diǎn)不同，還能縮短水解時間，提高酶水解物中的多肽含量并減少氨基酸含量。本實(shí)驗(yàn)在Alcalase堿性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶單酶水解黑豆蛋白的基礎(chǔ)上，在pH值漸變條件下，采用多酶組合分階段水解的方式，研究確定提高黑豆蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的多酶組合水解工藝，進(jìn)一步研究抗氧化黑豆肽的分離純化技術(shù)和氨基酸組成。

超濾膜分離技術(shù)具有設(shè)備操作方便、能耗低、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，是根據(jù)相對分子質(zhì)量大小分離蛋白肽類物質(zhì)的有效方法。大孔吸附樹脂是一類新型非離子型高分子吸附劑，具有條件溫和、容易再生、設(shè)備簡單、操作方便等特性，是根據(jù)分子極性大小對肽類物質(zhì)分離純化的有效方法之一[6]，已被廣泛應(yīng)用于生物活性肽的分離純化。氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)是目前國際上應(yīng)用范圍較廣且最為準(zhǔn)確的體外抗氧化活性檢測方法之一，具有生物相關(guān)性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，2004年在第一屆抗氧化方法國際會議上被推薦為抗氧化活性評價的標(biāo)準(zhǔn)方法之一[7-9]。本研究在多酶組合水解實(shí)驗(yàn)確定的抗氧化活性相對最強(qiáng)的黑豆蛋白酶解液超濾分離的基礎(chǔ)上，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對大孔樹脂吸附的黑豆肽進(jìn)行洗脫分級，以O(shè)RAC值為測定指標(biāo)評價超濾與大孔樹脂吸附分離純化抗氧化肽的效果，并通過測定黑豆肽氨基酸的組成，分析探討不同性質(zhì)氨基酸種類對抗氧化活性的貢獻(xiàn)，為功能性黑豆肽的開發(fā)應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

晚熟小粒黑豆由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種研究室提供。

Alcalase堿性蛋白酶(2.4AU/g)、Neutrase中性蛋白酶(0.8AU/g)和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶(500LAPU/g) 丹麥諾維信(Novozymes)生物技術(shù)有限公司(中國)；AB-8、D101大孔吸附樹脂 天津南開和成科技有限公司；DA201-C大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；HPD-400大孔吸附樹脂 滄州寶恩化工有限公司；熒光素鈉(FL)、自由基產(chǎn)生劑2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(C8H18N6·2HCl，AAPH)、水溶性VE(抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox) 美國Sigma-Alorich公司；還原型谷胱甘肽 美國Amresco公司；乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1全功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；ALPHA1-2 LO plus真空冷凍干燥機(jī) 德國Christe公司；Labscale TFF小型切向流超濾系統(tǒng) 美國Millipore公司；5417R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；HYG-Ⅱ恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ORAC的測定[10-11]

用磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀配制75mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，用磷酸鹽緩沖液配制10μmol/L的FL溶液、0.1mol/L的AAPH溶液和質(zhì)量濃度為1mg/mL的黑豆肽溶液。在96孔酶標(biāo)板中，依次加入25μL黑豆肽樣品、25μL FL溶液，最后用多道移液器迅速加入150μL AAPH誘發(fā)熒光淬滅反應(yīng)，空白以25μL緩沖液磷酸代替樣品。將微孔酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀振蕩8s，振蕩幅度4mm，在37℃條件下以激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm進(jìn)行連續(xù)測定，每1min測定1次各孔熒光強(qiáng)度，測定時間設(shè)定在熒光衰減呈基線后為止。應(yīng)用BioTek全功能酶標(biāo)儀Gen5 數(shù)據(jù)分析軟件得出熒光強(qiáng)度-時間曲線(熒光衰減曲線)下面的面積(AUC)，通過黑豆肽熒光衰減曲線的保護(hù)面積(netAUC)與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)水溶性VE(Trolox)及谷胱甘肽(GSH)的netAUC值比較，即可得出黑豆肽樣品的ORAC值，即Trolox當(dāng)量(μmol/L)和GSH當(dāng)量(mmol/L)。

1.3.2 黑豆肽的酶法水解工藝與超濾分離

黑豆去皮粉碎、脫脂，采用堿提酸沉法制備黑豆分離蛋白。在Alcalase堿性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶最適水解溫度和pH值條件下，對黑豆蛋白分別進(jìn)行單酶水解實(shí)驗(yàn)，測定酶解物的水解度(甲醛滴定法)[12]和ORAC值。具體水解工藝條件為：料液比1：10(m/V)，Alcalase堿性蛋白酶加酶量為蛋白質(zhì)底物含量的2%、pH8.5、溫度60℃；Neutrase中性蛋白酶加酶量為蛋白質(zhì)底物含量的2%、pH7.0、溫度50℃；Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶加酶量為蛋白質(zhì)底物含量的2%、pH7.0、溫度50℃。

在單酶水解實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Alcalase、Neutrase與Flavourzyme分階段水解的方式，對黑豆蛋白進(jìn)行雙酶或三酶組合水解實(shí)驗(yàn)。方法如下：先用Alcalase(溫度60℃、pH8.5)水解黑豆蛋白，約30min后pH值降到7.0左右，加熱鈍化Alcalase堿性蛋白酶，再按4種不同組合方式加入Neutrase或Flavourzyme于50℃溫度條件下進(jìn)一步水解，提高黑豆蛋白的水解度和多肽含量[13]，與單酶水解進(jìn)行比較，研究探討多酶水解不同組合方式對黑豆蛋白水解物ORAC值的影響。

采用Labscale TFF超濾系統(tǒng)對最佳酶解組合獲得的抗氧化活性相對最強(qiáng)的黑豆肽溶液進(jìn)行分離，控制蠕動泵轉(zhuǎn)速為25～35r/min，超濾膜板出口壓力為2.0×105Pa[14]，將相對分子質(zhì)量不同的各組分凍干后測其ORAC值。

1.3.3 大孔吸附樹脂對黑豆肽的靜態(tài)吸附與解吸[15]

將大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24h，用無水乙醇洗至220nm無吸收峰時，再用去離子水洗凈。稱取100g濕樹脂于250mL錐形瓶中, 加入pH4.0、20mg/mL超濾純化后的黑豆肽溶液100mL，置于25℃恒溫?fù)u床中150r/min振蕩吸附，每隔30min測定溶液中的肽含量，按公式(2)計算吸附率，確定吸附平衡時間。

式中：ρ0為原液中肽的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；ρ1為吸附后溶液中肽的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

對充分吸附黑豆肽的大孔樹脂進(jìn)行乙醇洗脫，每隔30min測定解吸液中的肽濃度，按公式(3)計算解吸率，確定解吸平衡時間。

式中：ρ0為原液的肽質(zhì)量濃度/(mg/mL)；ρ1為吸附后溶液的肽質(zhì)量濃度/(mg/mL)；ρ2為解吸液的肽質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V1為吸附液體積/mL；V2為解吸液體積/mL。

1.3.4 大孔樹脂吸附黑豆肽的乙醇分級洗脫[16]

黑豆蛋白水解液經(jīng)大孔吸附樹脂充分吸附后，抽濾，棄去未吸附的溶液，用體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、75%和100%的乙醇依次洗脫，分別收集洗脫液，再濃縮、冷凍干燥后得到黑豆肽分級組分，并按公式(4)計算肽得率。將乙醇洗脫分級各黑豆肽組分用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的肽溶液，測定比較其ORAC值。

式中：ρ1為原液的肽質(zhì)量濃度/(mg/mL)；ρ2為解吸液的肽質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V1為吸附液體積/mL；V2為解吸液體積/mL。

1.3.5 黑豆肽乙醇洗脫分級組分的氨基酸組成分析與疏水性值的計算[17]

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》測定黑豆肽乙醇洗脫分級組分的氨基酸組成。根據(jù)每種氨基酸的疏水值和黑豆肽的氨基酸組成，按公式(5)和(6)計算黑豆肽分級組分的平均疏水性值[10]。

式中：CAAi為100g黑豆肽中每種氨基酸的含量/g；Mi為各種氨基酸的摩爾質(zhì)量/(g/mol)；ΣCAAi/Mi為100g肽中氨基酸的總物質(zhì)的量/mol；Δfti為氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)杷?(kJ/mol)；Q為黑豆肽的平均疏水性/(kJ/mol)。

1.3.6 ORAC法Trolox與GSH當(dāng)量值相關(guān)性的統(tǒng)計檢驗(yàn)

采用Excel計算黑豆肽及其超濾組分與大孔樹脂分離組分ORAC 值Trolox當(dāng)量與GSH當(dāng)量值結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)r，通過查統(tǒng)計分析臨界r值表對相關(guān)系數(shù)r進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORAC標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖 1 不同濃度的Trolox熒光淬滅動力學(xué)曲線Fig.1 Fluorescence quenching dynamic curve of Trolox

由圖1可知，隨著Trolox濃度的增加熒光淬滅的時間逐漸延長，到達(dá)熒光衰減呈基線的時間從無Trolox時的20min增加到Trolox濃度為100μmol/L的50min。熒光動力學(xué)曲線下面的面積隨著Trolox濃度的增大而逐漸增大，Trolox濃度與熒光動力學(xué)曲線下面的保護(hù)面積netAUC值之間的線性方程為y= 55385.8258x+1217801.2500(R2=0.9924)。

圖 2 不同濃度的GSH熒光淬滅動力學(xué)曲線Fig.2 Fluorescence quenching dynamic curve of GSH

由圖2可知，隨著GSH濃度的增加熒光淬滅的時間逐漸延長，熒光動力學(xué)曲線下面的面積隨著GSH濃度的增大而逐漸增大，GSH濃度與熒光動力學(xué)曲線下面的保護(hù)面積netAUC值之間的線性方程為y=3384025.6367x+ 2156577.4886(R2=0.9961)。

2.2 黑豆蛋白單酶與多酶組合水解產(chǎn)物的氧自由基清除能力比較

由表1可知，在單酶最適水解條件下，Alcalase、Neutrase和Flavourzyme單酶水解180min后黑豆蛋白的水解度均基本不再增加，且酶解物的ORAC值(Trolox當(dāng)量和GSH當(dāng)量)均達(dá)到最大值，原因可能是在水解度較高時形成的水解產(chǎn)物會抑制反應(yīng)的進(jìn)行，而抗氧化活性與水解度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)關(guān)系。但在單酶水解度趨于最大時，黑豆蛋白Alcalase堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)，Neutrase中性蛋白酶水解物次之，F(xiàn)lavourzyme風(fēng)味蛋白酶水解物較差，說明不同蛋白酶具有不同的水解特異性。多酶組合水解采用以Alcalase堿性蛋白酶和Neutrase中性蛋白酶為主、輔以Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶短時間水解的組合3、組合4兩種組合方式的黑豆蛋白水解物的ORAC值均高于Alcalase單酶水解物，且達(dá)到水解度基本接近的水解時間從單酶水解的3h縮短為2h，說明通過合理的多酶組合水解方式可以提高酶解速率并改善水解液的抗氧化活性。采用Flavourzyme較長時間酶解與Alcalase堿性蛋白酶短時間水解組合方式2的黑豆蛋白水解物的ORAC值最低，可能是Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶含有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性，酶水解物中抗氧化性較弱的游離氨基酸比例增加所致。采用Neutrase中性蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶組合水解方式1的黑豆蛋白水解物ORAC值較低，可能與Neutrase中性蛋白酶的蛋白水解能力相對較弱，酶水解物的水解度較低有關(guān)。組合4的抗氧化活性高于組合3，原因可能是先采用含有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性的Flavourzyme水解，有利于增加后續(xù)Neutrase中性蛋白酶的水解作用位點(diǎn)，最終水解物的水解度相對較高。結(jié)果表明，組合4(Alcalase 30min＋Flavourzyme 30min＋Neutrase 60min)水解的黑豆蛋白水解物具有最高的氧自由基清除能力，因而選定該多酶組合酶解產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)抗氧化黑豆肽的超濾與大孔樹脂吸附分離純化。

表 1 黑豆蛋白單酶與多酶組合分步水解結(jié)果Table 1 Effect of three proteases, alone or in combination, on degree of hydrolysis and ORAC

2.3 黑豆肽的超濾分離及其氧自由基清除能力

采用(Alcalase 30min＋Flavourzyme 30min＋Neutrase 60min)多酶組合方式水解黑豆蛋白，經(jīng)冷凍干燥得到黑豆肽粉(BSP)，按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22492—2008《大豆肽粉》規(guī)定的肽含量的測定方法測得其肽含量為80.3%(干基)。分別用截留相對分子質(zhì)量為3000、5000和10000的超濾膜對黑豆肽水溶液分離，收集各超濾組分，凍干后用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的肽溶液，測定其ORAC值，黑豆肽BSP及其超濾分離組分的Trolox當(dāng)量和GSH當(dāng)量比較見表2。結(jié)果表明，相對分子質(zhì)量較小的黑豆肽組分具有較強(qiáng)的氧自由基清除能力，BSP-UF-Ⅳ超濾組分的Trolox當(dāng)量值為104.59μmol/L、GSH當(dāng)量值為1.43mmol/L，Trolox當(dāng)量和GSH當(dāng)量分別比超濾前提高了43.2%和55.4%，文獻(xiàn)[19]報道認(rèn)為大多數(shù)抗氧化肽的相對分子質(zhì)量小于3000，因而基于該組分進(jìn)行后續(xù)大孔樹脂吸附分離純化。

表 2 黑豆肽超濾分離組分的氧自由基清除能力Table 2 ORAC of the fractions purificated by ultrafiltration

2.3 黑豆肽的大孔樹脂吸附分離及其氧自由基清除能力

2.3.1 不同大孔吸附樹脂對黑豆肽的靜態(tài)吸附與解吸性能比較

圖 3 不同大孔樹脂對黑豆肽的靜態(tài)吸附曲線Fig.3 Static adsorption curves of different types of macroporous resin

圖 4 不同大孔樹脂對黑豆肽的靜態(tài)解吸曲線Fig.4 Static desorption curves of different types of macroporous resin

由圖3、4可知，前2h吸附率和解吸率均增加較快，2.5h后吸附率和解吸率都趨于平衡。DA201-C的吸附率和解吸率均大于其他樹脂，D101的吸附率和解吸率與DA201-C比較接近，其次為AB-8，而HPD400的吸附率和解吸率都較低。DA201-C和D101都是非極性樹脂，AB-8為弱極性樹脂，HPD400為中極性樹脂，據(jù)此推測非極性樹脂可能更適合于肽類物質(zhì)的吸附分離。DA201-C和D101的平均孔徑分別為3～5、9～10nm，DA201-C的比表面積約是D101的2倍，對小分子多肽有較多的吸附位點(diǎn)，有利于提高吸附和解吸效率，因此選擇DA201-C作為抗氧化黑豆肽分離純化實(shí)驗(yàn)用樹脂，這一結(jié)果與李勇等[20]的研究報道一致。

2.3.2 DA201-C大孔樹脂吸附黑豆肽的乙醇分級洗脫及其氧自由基清除能力

表 3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫組分的得率和氧自由基清除能力Table 3 Peptide yield and ORAC of each fraction eluted by different concentrations of ethanol

由表3可知，體積分?jǐn)?shù)為25%及50%乙醇洗脫的黑豆肽組分占69%，氧自由基清除能力較低；體積分?jǐn)?shù)為75%及100%乙醇洗脫的黑豆肽組分占31%，氧自由基清除能力較高，而75%乙醇洗脫組分BSP-DA-Ⅲ的ORAC值最高，其Trolox當(dāng)量和GSH當(dāng)量分別比吸附分離前提高了49.6%和51.7%，表明大孔樹脂吸附、乙醇分級洗脫對抗氧化黑豆肽具有較好的分離純化效果。

2.4 大孔樹脂吸附乙醇洗脫分離純化抗氧化黑豆肽的氨基酸組成分析

表 4 黑豆肽乙醇洗脫分級組分的氨基酸組成與疏水性值Table 4 Amino acid composition and hydrophobicity of each fraction eluted by different concentrations of ethanol

表 5 黑豆肽乙醇洗脫分級組分的平均疏水性值與疏水性氨基酸含量Table 5 Average hydrophobic value and hydrophobic amino acid content of each fraction eluted by ethanol with different concentrations

由表4、5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，洗脫組分的平均疏水性值和疏水性氨基酸含量呈明顯增大趨勢，該結(jié)果與張曉梅等[16]的相關(guān)研究報道一致，表明DA201-C型大孔吸附樹脂可以根據(jù)疏水性大小通過不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的分級洗脫對肽段進(jìn)行分離。

由表3、5可知，黑豆肽的抗氧化活性與肽段的疏水性有一定關(guān)系，隨著疏水性的增加，對氧自由基的清除能力總體呈增強(qiáng)趨勢，表明肽鏈中疏水性非極性氨基酸與肽段的抗氧化活性具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，75%和100%乙醇洗脫組分含有較高的酪氨酸，它具有酚羥基結(jié)構(gòu)，能提供質(zhì)子從而猝滅自由基，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，這與文獻(xiàn)[22-24]的研究結(jié)果一致。另有研究報道[25]認(rèn)為堿性氨基酸對多肽抗氧化活性的貢獻(xiàn)大于酸性氨基酸，因?yàn)閴A性氨基酸側(cè)鏈很容易被氧自由基攻擊氧化而生成羰基衍生物，可充當(dāng)清除氧自由基的角色，達(dá)到抗氧化的效果；75%乙醇洗脫組分BSP-DA-Ⅲ的賴氨酸、精氨酸、組氨酸等堿性氨基酸含量(10.46g/100g)遠(yuǎn)大于100%乙醇洗脫組分BSP-DA-Ⅳ(6.21g/100g)，因而BSP-DA-Ⅲ具有相對最強(qiáng)的氧自由基清除能力。

2.5 黑豆肽氧自由基清除能力Trolox當(dāng)量與GSH當(dāng)量的相關(guān)性分析

對黑豆肽BSP及其超濾組分BSP-UF-Ⅰ、BSPUF-Ⅱ、BSP-UF-Ⅲ、BSP-UF-Ⅳ和大孔樹脂分離組分BSPDA-Ⅰ、BSP-DA-Ⅱ、BSP-DA-Ⅲ、BSP-DA-Ⅳ的ORAC值Trolox當(dāng)量與GSH當(dāng)量值進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)r=0.9933，根據(jù)其自由度n－2=7，從統(tǒng)計檢驗(yàn)臨界r值表查得r0.01=0.798，故r=0.9933＞0.798，表明黑豆肽的Trolox當(dāng)量值與GSH當(dāng)量值呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，即用ORAC法GSH當(dāng)量值與Trolox當(dāng)量值評價黑豆肽的氧自由基清除能力具有一致性，本研究的抗氧化活性物質(zhì)是多肽，用還原型谷胱甘肽當(dāng)量表達(dá)其氧自由基清除能力，能較好地反映黑豆肽在抗氧化活性肽類物質(zhì)開發(fā)中的應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

采用單酶水解與多酶組合分階段水解工藝制備抗氧化黑豆肽，結(jié)果表明通過合理的多酶組合水解方式可以縮短水解時間并提高水解液的抗氧化活性，采用(Alcalase 30min＋Flavourzyme 30min＋Neutrase 60min)三酶組合水解2h與Alcalase單酶水解3h的水解度基本接近，與單酶水解抗氧化最強(qiáng)的Alcalase酶解物和其他多酶水解組合相比較，具有相對較強(qiáng)的氧自由基清除能力。對該最佳多酶組合水解物進(jìn)行超濾分離，相對分子質(zhì)量＜3000的黑豆肽超濾組分的抗氧化活性較強(qiáng)，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對充分吸附相對分子質(zhì)量＜3000黑豆肽超濾組分的DA201-C大孔樹脂進(jìn)行洗脫，可以根據(jù)氨基酸組成的疏水性值對抗氧化肽段進(jìn)行有效分離，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗脫的黑豆肽組分具有較強(qiáng)的氧自由基清除能力，表明采用大孔樹脂吸附、乙醇梯度洗脫是分離抗氧化活性肽的一種有效方法。75%乙醇洗脫分離的黑豆肽組分中非極性疏水性氨基酸、堿性氨基酸的含量較高，說明黑豆肽的抗氧化活性與其氨基酸組成側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)有高度的關(guān)聯(lián)性。ORAC法測定黑豆肽氧自由基清除能力的GSH當(dāng)量值與Trolox當(dāng)量值呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，GSH當(dāng)量值能直觀反映黑豆肽在抗氧化肽類物質(zhì)中的地位，Trolox當(dāng)量值則便于和其他類型的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行比較。

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