張 苗，武俊瑞，代金月，邱小玉，岳喜慶*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

豆醬(soybean paste)是我國四大傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品之一，它是以大豆為主要原料制成的醬，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動狀態(tài)的發(fā)酵食品，也稱黃豆醬、黃醬或大豆醬[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬具有獨特的風味，豆醬具有獨特的風味，其風味是由釀造過程中微生物引起的生物化學反應形成的。把原料中的不溶性高分子物質(zhì)，分解成低分子化合物，這些物質(zhì)的相互結合形成了種類繁多的呈味物質(zhì)[2]。這些呈味物質(zhì)主要是氨基酸。因此豆醬中氨基酸的種類和數(shù)量決定了豆醬的品質(zhì)，分析其含量和數(shù)量就顯得尤為重要。

氨基酸自動分析儀對所進樣品要求很嚴格，需要所進樣品除去有機酸、脂肪、蛋白等物質(zhì)。雖然樣品溶解在水中后，游離態(tài)氨基酸可溶解在水中，但非水解樣品溶液中的部分水溶性蛋白經(jīng)過高速離心仍無法除去，因此需選用蛋白沉淀劑除去經(jīng)高速離心后仍無法去除的水溶性蛋白[3]。三氯乙酸(TCA)沉淀法原理是：TCA作為蛋白質(zhì)變性劑可使蛋白質(zhì)構象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水基團，使之聚集沉淀[4]。本研究利用蛋白質(zhì)遇TCA產(chǎn)生沉淀的特點，結合雙縮脲比色法測其含量[5]，以此為指標來確定TCA沉淀測定豆醬游離氨基酸中蛋白的最佳實驗條件，為氨基酸含量測定提供簡便可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆醬，采自當?shù)剞r(nóng)家自制的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬，樣品保存于密封袋中，4℃冷藏備用。

酪蛋白標準品(生化試劑，純度≥99%) 北京世紀奧科生物技術有限公司；三氯乙酸(TCA)、氫氧化鉀溶液、酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、95%乙醇、四氯化碳(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；混合氨基酸標準溶液、茚三酮 德國Sykam公司；實驗用水為超純水；磺酸型陽離子樹脂分離柱(4.6mm×60mm，3μm) 日本Hitachi公司。

1.2 儀器與設備

CR22GⅡ/CR21GⅡ日立高速冷凍離心機 日立工機株式會社本社工廠；KQ-500DB型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；UV-5100B紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；L-8800全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品干燥

樣品在恒溫干燥箱中55℃烘干至恒質(zhì)量。

1.3.2 三氯乙酸沉淀蛋白與雙縮脲比色法測定蛋白質(zhì)含量[6-11]

1.3.2.1 標準曲線回歸方程的建立

準確稱取10、20、30、40、50、60mg酪蛋白標準品分別置于6個50mL離心管內(nèi)，各加入20.0mL雙縮脲試劑，搖勻。靜置10min后，以雙縮脲試劑調(diào)零，540nm波長處測定各標準溶液的吸光度，以吸光度(y)為縱坐標，以酪蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.1759x＋0.0023，r2=0.9994。

1.3.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定

稱取1g研磨均勻的豆醬干粉，加入8g/100mL TCA溶液，再充分研磨混勻轉移至50mL容量瓶，25℃水浴條件下超聲30min，10000r/min離心10min，傾去上清液，沉淀用95%乙醇10mL洗滌。向沉淀中加入四氯化碳2mL和雙縮脲試劑20mL，置于超聲波清洗器中振蕩均勻，靜置顯色10min，在10000r/min離心20min，取上層清液，540nm波長處測吸光度。試樣中蛋白質(zhì)含量以ρ(g/100g)表示，結果按下式計算，實驗平行測定3次。

式中：m0為取樣量/mg；A540nm為測得的吸光度。

1.3.3 單因素試驗

分別考察沉淀劑TCA質(zhì)量濃度、沉淀溫度、離心轉數(shù)3個因素對前處理中蛋白質(zhì)沉淀效果的影響，以蛋白質(zhì)含量為評定指標。

表1 單因素試驗設計Table 1 One-factor-at-a-time design

1.3.4 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗確定各因素的取值水平范圍，結合Box-Behnken試驗設計原理，分別選取TCA質(zhì)量濃度(A)、沉淀溫度(B)、離心機轉數(shù)(C)作為自變量，以蛋白質(zhì)含量作為響應值設計響應面試驗。利用Design-Expert 7.0軟件進行回歸分析，預測沉淀蛋白質(zhì)的最佳條件。

1.3.5 游離氨基酸測定

稱取研磨均勻的豆醬干粉1g，加入8.3g/100mL的TCA溶液，再充分研磨混勻轉移至50mL容量瓶，47℃溫度條件下超聲波超聲提取1h，1726r/min離心30min，取上清液2mL于蒸發(fā)皿中蒸干。加入2.5mL 0.02mol/L的鹽酸溶液溶解，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾，作為待測液。

色譜條件[12]：色譜柱：磺酸型陽離子樹脂分離柱(4.6mm×60mm，3μm)；梯度洗脫：循環(huán)時間53min，分離柱柱溫57℃，反應柱柱溫135℃，緩沖液流速0.4mL/min，茚三酮流速0.35mL/min；通道1：檢測波長570nm，采集時間32min；通道2：檢測波長440nm，采集時間10min；進樣量20μL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

蛋白質(zhì)沉淀效果受T C A 質(zhì)量濃度、沉淀溫度和離心轉數(shù)影響，由圖1 可知，T C A 質(zhì)量濃度在2～10g/100mL時，測定樣品中蛋白質(zhì)含量呈上升的趨勢，8g/100mL以后趨于平穩(wěn)，考慮到過高的TCA會對氨基酸檢測帶來影響，故選擇8g/100mL TCA質(zhì)量濃度。TCA質(zhì)量濃度從2～10g/100mL時，酸度逐漸增強，TCA在酸性條件下與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽，并作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團，使蛋白質(zhì)聚集沉淀[13]。此外，沉淀溫度對蛋白質(zhì)沉淀效果也存在影響，當反應溫度從25℃升至65℃時，蛋白質(zhì)含量增加不明顯，可見溫度對TCA沉淀蛋白質(zhì)作用影響不大，這與任國譜等[14]的報道是一致的。但隨溫度的提高，分子運動速率提高，蛋白質(zhì)沉淀速率加快，有助于縮短反應時間，綜合考慮選擇溫度45℃。隨離心轉數(shù)的增加，蛋白質(zhì)含量呈上升的趨勢，16000r/min后趨于平穩(wěn)，當離心轉數(shù)16000r/min，測定樣品中蛋白質(zhì)含量達到最高值。

圖 1 TCA質(zhì)量濃度(a)、沉淀溫度(b)、離心轉數(shù)(c)對蛋白質(zhì)沉淀的影響Fig.1 Effect of three factors on protein precipitation

2.2 響應面法優(yōu)化蛋白沉淀條件

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理[15-17]，選擇TCA質(zhì)量濃度(A)、沉淀溫度(B)、離心轉數(shù)(C)，作為響應面優(yōu)化的考察因素，每個因素取三水平，以(－1，0，1)編碼，以測定的蛋白質(zhì)含量為響應值，設計三因素三水平試驗。試驗因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素及水平Table 2 Variables and coded values for Box-Behnken design

應用Design-Expert 7.0軟件進行Box-Behnken試驗設計，依次進行試劑的配制，蛋白質(zhì)含量測定(每組3個平行)[18-19]，以樣品中蛋白質(zhì)含量為響應值(Y)，進行響應面試驗，結果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken design

2.2.2 回歸模型的建立及統(tǒng)計分析

根據(jù)表3的試驗結果，通過Design Expert 7.0軟件處理確定回歸方程，該試驗的回歸方程為：Y=23.16＋0.33A＋0.32B＋0.43C＋0.23AB＋0.23AC＋0.25BC－1.43A2－0.95B2－0.83C2(1)

回歸模型進行方差分析及可信度分析結果見表4。

表4 回歸方程的統(tǒng)計分析Table 4 Statistical analysis of the fitted regression equation

由表4可知，TCA質(zhì)量濃度和沉淀溫度的二次項對蛋白質(zhì)沉淀效果影響均具顯著性(P＜0.01)，離心轉數(shù)和它的二次項對蛋白質(zhì)沉淀效果影響也具顯著性(P＜0.05)，其他變量影響均不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計學差異。根據(jù)α=0.05顯著水平剔除不顯著項，簡化后的回歸方程為：

根據(jù)表4可知，模型極顯著(P＜0.01)，因變量與自變量之間的線性關系顯著(R2=0.9445)，模型調(diào)整復相關系數(shù)R2Adj=0.8447，說明該模型能解釋84.47%響應值的變化，擬合程度較好。失擬項不顯著(P＞0.05)，說明試驗所得二次回歸方程能很好地對響應值進行預測[20-21]。

2.2.3 蛋白沉淀條件的響應面分析及優(yōu)化

圖 2 Y=f(A，B)響應面立體圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of precipitant concentration and temperature on protein precipitation

圖 3 Y=f(A，C)響應面立體圖及等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots showing the effects of precipitant concentration and centrifuge speed on protein precipitation

圖 4 Y=f(B，C)響應面立體圖及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of temperature and centrifuge speed on protein precipitation

根據(jù)回歸方程繪制響應面分析圖，運用Design Expert 7.0軟件對模型進行分析，尋求蛋白質(zhì)含量的穩(wěn)定點及對應的因素水平，由圖2～4可知，回歸模型存在穩(wěn)定點，穩(wěn)定點即極大值點，通過對回歸模型求一階偏導，得到各因素A、B、C的編碼值為0.1588、0.2283、0.3160，利用編碼公式Xi=(Xj－X0)/Δj將上述編碼值轉變?yōu)閷嶋H參數(shù)為TCA質(zhì)量濃度8.320g/100mL、沉淀溫度47.280℃、離心轉數(shù)1726.060r/min，考慮實際操作性，將各沉淀工藝參數(shù)修正為TCA質(zhì)量濃度8.3g/100mL、沉淀溫度47℃、離心轉數(shù)1726r/min。此時蛋白質(zhì)沉淀效果最佳，為23.29g/100g。為了檢驗回歸模型預測的準確性，在所得最佳沉淀條件下進行3組平行實驗進行驗證，沉淀中蛋白質(zhì)實際含量分別為23.12、23.09、23.18g/100g，與預測值十分接近，可見該模型能較好地預測實際蛋白質(zhì)沉淀情況。

2.3 豆醬中游離氨基酸含量測定

圖 5 處理后豆醬中游離氨基酸測定色譜圖Fig.5 Chromatogram of free amino acids in fermented soybean paste after protein removal

采用最佳蛋白質(zhì)沉淀操作條件處理后，按照1.3.5節(jié)方法測定樣品中游離氨基酸含量，結果見圖5。

由圖5可以看出，豆醬中的氨基酸分離效果很好，并且在檢測過程中柱壓穩(wěn)定。

3 結 論

通過單因素試驗和Box-Behnken試驗，采用響應面分析法優(yōu)化豆醬中蛋白質(zhì)沉淀條件，得出沉淀工藝條件參數(shù)為TCA質(zhì)量濃度8.3g/100mL、沉淀溫度47℃、離心轉數(shù)1726r/min，此條件下蛋白質(zhì)沉淀量可達到23.29g/100g。并采用此法沉淀蛋白質(zhì)后進行豆醬中游離氨基酸含量測定，各氨基酸分離效果很好，并且柱壓穩(wěn)定，由此可知樣品中的蛋白充分的得到清除。

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