汪 淼，李 張，張 杰，馮 甦，孫 群，楊志榮*

(四川大學(xué)生命科學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610064)

資中冬尖是四川省的名特產(chǎn)品，不僅蜚聲國內(nèi)，在世界上也頗有盛名。資中冬尖是以芥菜為原料經(jīng)特定工藝腌制而成的干態(tài)發(fā)酵制品。資中冬尖制造工藝的特征是先在風(fēng)中晾曬，使之脫水，然后再進行鹽漬，用此加工過程可以避免蔬水中所含可溶性物質(zhì)的流出[1]。資中冬尖的發(fā)酵周期較長，一般為1～4年，隨著發(fā)酵時間越長，其風(fēng)味及香氣越濃郁，質(zhì)量越好。成品冬尖呈褐黑色，味鮮細嫩，咸淡適口，回味帶甜，深受消費者喜歡。目前對資中冬尖的研究主要集中在冬尖的發(fā)酵工藝[1-3]和其發(fā)酵過程中微生物菌群的變化[4]兩方面，而對資中冬尖揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分離鑒定研究較少。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)作為檢測和鑒定風(fēng)味物質(zhì)的一種高效、簡捷的方法已廣泛用于食品風(fēng)味物質(zhì)的檢測，但其檢測靈敏度與可靠性很大程度上依賴于樣品的處理方法[5]。頂空固相微萃取法(headspacesolid phase micro extraction，HS-SPME)是一種新的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)樣本采集技術(shù)，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、分離效果佳、分離物質(zhì)多等特點，目前被廣泛用于食品風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測[6-7]。本實驗采用頂空固相微萃取法提取資中冬尖中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，并應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其風(fēng)味成分進行分離鑒定，旨在揭示不同發(fā)酵時期資中冬尖揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化趨勢，并探究發(fā)酵時間對冬尖揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響規(guī)律，為不同發(fā)酵時期的冬尖提供化學(xué)成分的質(zhì)量檢測指標，同時也為冬尖風(fēng)味物質(zhì)形成的原理以及改善其生產(chǎn)加工工藝，特別是縮短生產(chǎn)周期提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

不同發(fā)酵年份(1～4年)的資中冬尖均由匯源集團資中佳釀食品廠提供。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE GC DSQⅡ氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Thermoquest-Finnigan公司；SPME手動進樣裝置(包括SPME手柄，聚四氟乙烯平墊，85μm PA萃取頭) 美國Supelco公司；20mL頂空進樣瓶 德國Agilent Technologies公司；CS501超級恒溫水浴鍋 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPEM頂空萃取操作條件[8-9]

取適量樣品置于20mL頂空進樣瓶中，于磁力攪拌器上65℃熱平衡30min，將頂空萃取頭深入頂空瓶中，伸出纖維于上空氣體中，不與樣品接觸，萃取吸附15min后縮回纖維頭，然后把萃取頭插入GC進樣口，伸出纖維解吸5min后縮回纖維，取出萃取頭，進行分析。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件[10-12]

氣相色譜條件：進樣口溫度：250℃；載氣(He)流速：1mL/min；起始柱溫：40℃，保持5min；再以5℃/min升至220℃，保持5min。

質(zhì)譜條件：電子電離(electron inozation，EI)源的電子強度：70eV；離子源溫度：230℃；掃描范圍：35～400u；分流比10：1。

1.4 化合物定性定量方法

由 GC-MS 得到的譜圖，經(jīng)計算機在(NIST 2005)標準譜庫的檢索，確定出揮發(fā)性風(fēng)味成分。僅報道匹配度大于800(最大值1000)的鑒定結(jié)果；化合物相對含量采用峰面積歸一化法進行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份冬尖樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS分析

第1年冬尖樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分離子流圖見圖1A，共鑒定出9類45種化合物(表1)，總相對含量為98.94%。其中：烴類23種，占總色譜流出峰面積的相對含量最高，為66.92%；酯類8種，相對含量15.72%；雜環(huán)類1種，相對含量5.76%；醇類4種，相對含量3.7%；含硫化合物4種，相對含量3.09%；酮類1種，相對含量1.72%；芳香類2種，相對含量1.19%，醛類1種，相對含量0.47%；酸類1種，相對含量0.37%。

圖 1 不同年份冬尖揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compounds in Dongjian fermented for different years

第2年冬菜樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分離子流圖見圖1B，共鑒定出7類39種化合物(表1)，總相對含量為99.32%。其中：酯類16種，占總色譜流出峰面積的相對含量最高，為60.54%；芳香類4中，相對含量7.69%；含硫化合物3種，相對含量7.4%；烴類8種，相對含量7.33%；酮類4種，相對含量7.20%；酸類1種，相對含量5.63%；醇類3種，相對含量3.53%。

第3年冬菜樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分離子流見圖1C，共鑒定出7類36種化合物(表1)，總相對含量為97.96%。其中：酯類22中，占總色譜流出峰面積的相對含量最高，為87.89%；酮類3種，相對含量4.00%；烴類6種，相對含量2.57%；含硫化合物2種，相對含量1.91%；芳香類1種0.77%；酸類1種，相對含量0.47%；醛類1種，相對含量0.34%。

第4年冬菜樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分離子流見圖1D，共鑒定出7類27種化合物(表1)，總相對含量為97.64%。其中：酯類13種，相對含量35.88%；酮類3種，相對含量26.17%；含硫化合物2種，相對含量24.31%；醇類3種，相對含量5.22%；芳香類3種，相對含量2.62%；烴類2種，相對含量2.35%；醛類1種，相對含量0.57%。

表1 不同年份冬尖揮發(fā)性風(fēng)味成分相對含量Table 1 Identified volatile compounds of Dongjian fermented for different years %

續(xù)表1

由表1可看出，各類化合物在不同年份的冬尖樣品中所占比重不同。烴類物質(zhì)在第1年冬尖樣品中是最主要的成分，其相對含量最高，為66.92%，這可能是因為第1年冬尖發(fā)酵還不完全，香味物質(zhì)沒有完全形成，而是產(chǎn)生了很多風(fēng)味前體烷烴類物質(zhì)。從第2年開始烴類物質(zhì)的種類和其相對含量都急劇下降，到第4年烴類物質(zhì)只剩下2種，其相對含量僅2.35%。由此可見，烴類物質(zhì)在第1年冬尖樣品中占主要地位，但隨著發(fā)酵時間的延長，烴類物質(zhì)已不再是冬尖樣品中的主要揮發(fā)性成分。

第1年冬尖樣品檢出8種酯類，相對含量為15.72%；第2年冬尖樣品檢出16種酯類，相對含量為60.54%，由此可見，第1年至第2年酯類物質(zhì)種類和其相對含量都急劇增加。在第2、3、4年冬尖樣品中酯類物質(zhì)均是其最主要的揮發(fā)性成分，尤其是在第3年冬尖樣品中酯類物質(zhì)相對含量高達87.89%，但在第4年冬尖樣品中酯類物質(zhì)所占比重有所減少。冬尖發(fā)酵過程中，酯類物質(zhì)的形成途徑可能有2條：一是由有機酸和醇通過非酶催化的酯化反應(yīng)形成；二是由酵母在發(fā)酵過程中催化生成[13-14]。早在1995年，萬波等[4]就對冬尖發(fā)酵過程中微生物菌群的變化做了相應(yīng)研究并提出：發(fā)酵第1年的優(yōu)勢菌群主要是兼性菌群和少量酵母菌群，第2年酵母菌群顯著增加，第3、4年酵母菌群有所下降而嗜鹽菌成為主要菌群。這種微生物菌群的變化可能從一定程度上解釋了第1年酯類較少，第2年酯類顯著增加的現(xiàn)象。第3年酯類相對含量增加可能是由于此時第一條酯類合成途徑占主導(dǎo)或嗜鹽菌在酯類形成方面也具有一定的作用。第4年酯類相對含量減少除了可能與酯類形成途徑和微生物菌群變化有關(guān)，還可能與酮類物質(zhì)和含硫化合物在第4年樣品中所占相對含量較前3年急劇增加有關(guān)。第4年冬尖樣品中酯類(35.88%)、酮類(26.17)、含硫化合物(24.31%)所占相對含量相近，可能正是因為這個原因使第4年冬尖樣品不以某一類揮發(fā)性物質(zhì)的香氣為主導(dǎo)，而是除了酯香外還均衡的融合了酮類和含硫化合物的香氣，從而使第4年冬尖樣品的風(fēng)味更加豐富。

在本研究中僅檢測出了1種酸類物質(zhì)，但大量脂肪酸酯的存在表明樣品中可能含有不同的脂肪酸。在1、2、3、4年冬尖樣品中均未檢測出乳酸或與乳酸相應(yīng)的酯類物質(zhì)，這一點與萬波等[4]提出的在冬尖發(fā)酵過程中乳酸菌受到抑制，不是主要菌群相一致。

2.2 不同年份冬尖樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的異同

第1年冬尖樣品檢出揮發(fā)性成分中相對含量較高的有十七烷(10.09%)、正葵酸正葵酯(9.46%)、十六烷(8.29%)、2,6,10-三甲基十六烷(8.23%)、十八烷(5.81%)、植烷(5.78%)，其中除了十六烷外其余4種物質(zhì)均是第1年的獨有成分；第2年冬尖樣品檢出揮發(fā)性成分中相對含量較高的有棕櫚酸乙酯(20.67%)、棕櫚酸甲酯(9.18%)、正己酸乙酯(8.73%)、庚酸乙酯(6.27%)、異硫氰酸烯丙酯(6.15%)，其中正己酸乙酯是其獨有成分；第3年冬尖樣品檢出揮發(fā)性成分中相對含量較高的有辛酸乙酯(27.85%)、壬酸乙酯(14.17%)、棕櫚酸乙酯(18.45%)，辛酸異戊酯(3.56%)，其中辛酸異戊酯是第3年冬尖樣品的獨有成分；第4年冬尖樣品檢出揮發(fā)性成分中相對含量較高的有β-紫羅蘭酮(24.57%)、異硫氰酸烯丙酯(19.74%)、棕櫚酸乙酯(9.85%)、辛酸乙酯(6.53%)、棕櫚酸甲酯(4.89%)、異硫氰酸環(huán)丙酯(4.57%)，在第4年冬尖樣品中并沒檢測出相對含量較高的獨有成分。

由上述結(jié)果可看出，在各年份冬尖樣品中其主要揮發(fā)性物質(zhì)存在一定的異同。第1年冬尖樣品中的主要成分幾乎全為烴類，烷烴類物質(zhì)的香氣閾值較高對冬尖風(fēng)味的貢獻較小，但一些支鏈烷烴和烯烴除外[15]；第2、3年冬尖樣品中其主要成分幾乎全為酯類，酯類物質(zhì)對冬尖樣品的風(fēng)味形成起著重要作用。低級飽和單羧酸或多數(shù)不飽和單羧酸與低級飽和醇形成的酯，都具有愉快的水果香氣，而脂肪酸酯類物質(zhì)具有酯香味，且沸點高、揮發(fā)慢,從而使香味持久[16]。第4年冬尖樣品中的主要成分除了酯類還有酮類和含硫化合物，從而提高了第4年冬尖的質(zhì)量，使其風(fēng)味較前3年更豐富。第1年冬尖樣品不含有與后3年樣品相同的主要成分，而后3年樣品兩兩之間或者三者之間都具有相同的主要成分，由此可見，第1年冬尖樣品的風(fēng)味與后3年冬尖樣品的風(fēng)味有較大差異，而后3年冬尖樣品的風(fēng)味更相似。

1、2、3、4年冬尖樣品中所共有的揮發(fā)性成分有8種，分別為：辛酸乙酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯、棕櫚酸甲酯、6,9,12,15-二十二碳四烯酸甲酯、棕櫚酸乙酯、β-紫羅蘭酮、異硫氰酸烯丙酯、異硫氰酸環(huán)丙酯。由此可見，發(fā)酵過程中，冬尖香氣在發(fā)生變化的同時也保持了一定的前后同源性。二氫獼猴桃內(nèi)酯是20個世紀60年代從獼猴桃屬木天蓼植物中分離得到的一種天然成分，具有典型的木香、茶香和桃子香氣、二氫獼猴桃內(nèi)酯獨特的香氣影響著卷煙的香氣質(zhì)量從而深受調(diào)香師的青睞[17-18]。β-紫羅蘭酮具有濃郁的紫羅蘭香氣，與煙草的木香相似，且?guī)в刑鸬母嘞愫凸悖且环N名貴香料，廣泛用于食品、香料和及化妝品中，同時β-紫羅蘭酮也是一種重要的醫(yī)藥中間體，是合成VA、VE、β-胡蘿卜素、視黃酸、葉綠醇等的重要原料。此外，近年來的研究[19-20]表明，β-紫羅蘭酮具有較強的生物活性，特別是對腫瘤的發(fā)生有明顯的抑制作用。異硫氰酸酯類化合物被認為是含介子苷類十字花科蔬菜及其加工產(chǎn)品的獨特風(fēng)味物質(zhì)。其前體芥子苷在蔬菜加工過程中與芥子苷酶相接觸從而水解產(chǎn)生異硫氰酸酯類物質(zhì)。異硫氰酸酯特別是異硫氰酸烯丙酯具有強烈的催淚性和辛辣味，同時也具有芳香味。此外，有研究表明異硫氰酸酯類化合物對致癌劑誘發(fā)的乳腺癌、前胃癌和肺癌有明顯的抑制作用[21-23]。

3 討論與結(jié)論

采用HS-SPEM方法提取資中冬尖1、2、3、4年樣品中的揮發(fā)性成分，并應(yīng)用GC-MS技術(shù)和面積歸一法分別從4個樣品中鑒定出45、39、36、27種化合物，共計147種，其中主要包括酯、烴、醛、酮、醇、酸、含硫化合物、芳香化合物、雜環(huán)化合物共9類物質(zhì)。第1年冬尖樣品以烴類物質(zhì)(66.92%)為主，其主要成分為十七烷、正葵酸正葵酯、十六烷、2,6,10-三甲基(8.23%)、十八烷、植烷；第2年冬尖樣品以酯類物質(zhì)為主，其主要成分為棕櫚酸乙酯、棕櫚酸甲酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、異硫氰酸烯丙酯；第3年冬尖樣品酯類物質(zhì)相對含量高達87.89%，其主要成分為辛酸乙酯(27.85%)、壬酸乙酯(14.17%)、棕櫚酸乙酯(18.45%)、辛酸異戊酯(3.56%)；第4年冬尖樣品酯類(35.88%)、酮類(26.17%)、含硫化合物(24.31%)的相對含量均較高，其主要成分為β-紫羅蘭酮、異硫氰酸烯丙酯、棕櫚酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸甲酯(4.89%)、異硫氰酸環(huán)丙酯。在發(fā)酵過程中，冬尖的香氣成分發(fā)生著生成、更替、消失的動態(tài)變化過程，從而使不同時期的冬尖呈現(xiàn)出不盡相同的風(fēng)味特征，總的來說，第1年冬尖樣品的風(fēng)味與后3年差異較大，后3年冬尖樣品的風(fēng)味更相近，第4年冬尖樣品的風(fēng)味較前3年更豐富。

在發(fā)酵過程中，冬尖香氣在發(fā)生變化的同時也保持了一定的同源性。在1、2、3、4年冬尖樣品中共檢出8種相同的揮發(fā)性成分且相對含量均較高，分別為：辛酸乙酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯、棕櫚酸甲酯、6,9,12,15-二十二碳四烯酸甲酯、棕櫚酸乙酯、β-紫羅蘭酮、異硫氰酸烯丙酯、異硫氰酸環(huán)丙酯。其中，β-紫羅蘭酮和異硫氰酸酯還具有一定的生理功能，對于這些成分應(yīng)加以重視。資中冬尖具有十分復(fù)雜的香味，不能單用一種香味來形容，其獨特的風(fēng)味是由冬尖中豐富的揮發(fā)性成分共同作用過的結(jié)果。

資中冬尖揮發(fā)性成分的形成可能是由內(nèi)源酶和微生物共同作用的結(jié)果，其中酵母菌與嗜鹽菌在冬尖發(fā)酵過程中起著重要作用，而乳酸菌受到一定抑制，不是其主要菌群。對于冬尖發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分形成的具體機理還有待進一步研究。本實驗為進一步了解發(fā)酵過程中冬尖揮發(fā)性成分的變化，改進其加工工藝，提高冬尖產(chǎn)品的質(zhì)量提供了參考。

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