李婷婷，勵建榮*，趙 崴

(1.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧 錦州 121013；3.大連天寶綠色食品股份有限公司，遼寧 大連 116001)

美國紅魚(red drum，Sciaenops ocellatus)，學(xué)名眼斑擬石首魚，俗稱紅魚、紅姑魚、斑尾魚、海峽鱸，為鱸形目、石首魚科、擬石首魚屬，屬廣溫廣鹽溯河性魚類，淡水、半咸水、海水中均可正常生長，是一種商品經(jīng)濟價值較高的海產(chǎn)魚類。魚體內(nèi)含有多種無機鹽、維生素和微量元素等，同時具有豐富的營養(yǎng)價值和良好的保健功能。美國紅魚作為一種高蛋白、低脂肪的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類，現(xiàn)已成為世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚種之一，也是國際上高檔的熱銷水產(chǎn)品之一[1]。

然而，作為水產(chǎn)品的一般特性，美國紅魚由于其較高的水分和蛋白質(zhì)含量，肌肉組織較松軟，組織蛋白酶活性較強，死后僵硬期短，自溶作用快，極易在捕撈、運輸、加工及貯藏過程中受細(xì)菌侵襲而腐敗變質(zhì)，導(dǎo)致貨架期短、難以保藏[2-3]。為此，尋求一種既經(jīng)濟又安全且操作簡便的保鮮技術(shù)，在不添置任何附加設(shè)備的情況下，采用新穎安全的生物保鮮劑來延長美國紅魚的貨架期，已成為目前水產(chǎn)品加工業(yè)極需解決的課題。隨著我國美國紅魚養(yǎng)殖業(yè)和產(chǎn)量的逐年擴增，美國紅魚的保鮮加工必將成為今后長期主要工作之一。

殼聚糖(chitosan)又稱甲殼素(chitin)、幾丁質(zhì)、脫乙酰甲殼素、聚氨基葡萄糖等，是甲殼素N-脫去乙酰基的產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是由大部分氨基葡萄糖和少量的N-乙酰葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接起來的聚陽離子高分子直鏈多糖。由于其是天然多糖中大量存在的唯一堿性氨基多糖，其來源豐富，制備簡單，保鮮性能優(yōu)越，同時具有抑菌等一系列特殊的功能性質(zhì)，而且其降解產(chǎn)物一般在人體內(nèi)不積蓄，對人體也無毒副作用、無免疫原性[4-6]。目前，殼聚糖在食品中常作為抑菌保鮮劑，不僅可在果蔬保鮮中受到廣泛的應(yīng)用，同時也在水產(chǎn)品貯藏過程中得到了普遍的應(yīng)用[7-8]。但利用殼聚糖涂膜保鮮美國紅魚片還沒有相關(guān)的研究，鑒于此，本研究分析了不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜后對美國紅魚品質(zhì)的變化，并通過檢測其微生物、pH值、硫代巴比妥酸(TBA)值、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量、K值以及質(zhì)構(gòu)、感官等鮮度指標(biāo)來比較不同質(zhì)量濃度殼聚糖對美國紅魚品質(zhì)的影響，為殼聚糖涂膜在美國紅魚保鮮中的進一步應(yīng)用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美國紅魚 市購；殼聚糖(脫乙酰度為大于85%，食品級) 寧波市鎮(zhèn)海海鑫生物制品有限公司；ATP關(guān)聯(lián)物ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx 標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 LC液相儀 美國Agilent公司；CR400 色差儀 日本KonicaMinolta公司；KJELTEC2300全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；UV-2000紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋、GRP-9080隔水恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；BS223S精密電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；BCD-277西門子冰箱 博西華家用電器有限公司；PHS-3E PH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀 Stable Micro Systems公司；THZ-C-1恒低溫氣浴搖床 上海豐盟科技材料有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美國紅魚處理方式

將鮮活美國紅魚采用碎冰凍死后，用雙蒸水清洗、并切成長5cm寬2cm厚1cm的魚片。然后將瀝干的魚片分成5組，分別浸泡于不同質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液(殼聚糖的水溶液在4℃冰庫中預(yù)冷卻)：A為0.5%冰乙酸+0.5%甘油(對照組)；B、C、D、E為在對照組的配方基礎(chǔ)上添加質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0、3.0g/100mL殼聚糖。浸泡時間為10min(冰乙酸甘油均為體積分?jǐn)?shù))。取出瀝干后，采用蒸煮袋包裝于4℃冰箱中貯藏。樣品分別在第0、4、8、12、16、20天取樣測定其感官、微生物以及各個理化指標(biāo)的變化。每次隨機取樣3組，測平均值。

1.3.2 測定指標(biāo)

魚肉基本營養(yǎng)成分：水分含量按照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中直接干燥法測定，在105℃條件下干燥至恒質(zhì)量；蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定，蛋白質(zhì)系數(shù)選擇6.25；脂肪含量按GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中酸水解法測定；灰分含量按GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》測定；細(xì)菌總數(shù)的測定：按GB 4789.2—2010《菌落總數(shù)測定》進行測定，采用平板傾注法計數(shù)測定；pH值測定：依照GB/T 5009.45—2003《水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的酸度計法，稱取5～8g左右攪碎魚肉，加入10倍質(zhì)量體積新煮沸后冷卻的雙蒸水，均質(zhì)，靜止過濾后，測其上清液pH值。

TBA值測定：參考Siu等[9]的TBA測定方法，稱取10g攪碎魚肉，加入25mL雙蒸水，均質(zhì)后，再加入25mL 5g/100mL三氯乙酸(TCA)攪勻，靜止30min。然后，取5mL上清液，加入5mL 0.02mol/L的TBA溶液?；旌弦涸?0℃恒溫水浴加熱40min顯色，冷卻至室溫后，在532nm波長處測定吸光度。TBA值用丙二醛(MDA)的含量表示，單位為mg MDA/kg。

TVB-N含量測定：使用全自動定氮儀，參考“FOSS應(yīng)用子報[10]”中《鮮魚和凍魚中揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定》測定魚丸中的TVB-N含量(mg/100g)。

K值的測定：按照Ryder等[11]的方法，美國紅魚片ATP關(guān)聯(lián)物的提?。喝?g魚肉加入25mL 冷卻的高氯酸(10g/100mL)，勻漿后3000×g離心10min 去沉淀，取上清液10mL，用1mol/L KOH調(diào)節(jié)pH值至6.5～6.8。靜置15min 后于3000×g離心10min，取上清液，將其置于50mL容量瓶定容，溶液用0.45μm的水相濾膜過濾后，將其放置于－80℃凍藏用于后期檢測。整個過程均在0～4℃條件下操作。ATP關(guān)聯(lián)物高效液相色譜(HPLC)檢測條件：色譜柱BDS C18(250mm×4.6mm)，以0.04mol/L磷酸二氫鉀和0.06mol/L磷酸氫二鉀混和液作為流動相進行平衡、洗脫。上樣量1μL，流速1mL/min，柱溫37℃，于254nm波長處檢測。

式中：CHxR為肌苷含量/(μmol/g)；CHx為次黃嘌呤含量/(μmol/g)；CATP為腺嘌呤核苷三磷酸含量/(μmol/g)；CADP為腺嘌呤核苷一磷酸含量/(μmol/g)；CAMP為腺嘌呤核苷含量/(μmol/g)；CIMP為次黃嘌呤核苷含量/(μmol/g)。

質(zhì)構(gòu)分析：將美國紅魚片切成正方體，采用質(zhì)構(gòu)測定儀室溫下測定。測定條件如下：每個樣品進行兩次軸向壓縮，壓縮百分比為50%，測試探頭類型：P/50R，測前速率：1mm/s，測試速率：lmm/s，測后速率：1mm/s，探頭2次測定間隔時間：5s，測定模式和選項：T.P.A，每次取不同魚片重復(fù)測量3次，取平均值。

感官評分：由6名專業(yè)人員組成的感官評定小組進行，針對美國紅魚片的外觀、氣味、色澤、彈性4個方面為檢驗項目，以4個檢驗項目得分的平均值為魚肉感官評分，如表1所示。

表1 美國紅魚片感官評分表Table 1 Sensory evaluation of red drum fillets

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗重復(fù)2 次，每次各數(shù)據(jù)進行3 次重復(fù)測定(n=2×3)，通過肖維勒準(zhǔn)則對可疑值進行剔除，采用Origin 7.5繪圖，SPSS 11.0進行方差分析。P＜0.01為極顯著，P＜0.05為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 美國紅魚片基本營養(yǎng)成分

美國紅魚片的水分含量為78.4%，粗脂肪含量為0.71%，粗蛋白含量高達(dá)19.03%，灰分含量為1.18%。與劉世祿等[3]測得的美國紅魚肌肉營養(yǎng)組成相似，顯然，美國紅魚是一類高蛋白低脂肪的水產(chǎn)品，具有開發(fā)應(yīng)用價值。

2.2 不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜對美國紅魚片細(xì)菌總數(shù)的影響

引起魚類等水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要因素一般包括3種：微生物、酶促作用和化學(xué)變化，其中微生物是導(dǎo)致多數(shù)水產(chǎn)品腐敗的主要因素，腐敗微生物的生長狀況可以反映出水產(chǎn)品的腐敗程度。不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜的美國紅魚片在4℃冷藏時細(xì)菌總數(shù)變化如圖1所示。美國紅魚片的初始細(xì)菌總數(shù)為3.69(lg(CFU/g))。按GB 2741—1994《海蝦衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，細(xì)菌總數(shù)不大于105個/g為一級鮮度，不大于5×105個/g為二級鮮度，達(dá)到106～107個/g時，通常表明已極其腐敗，不能食用，此時判定為貨架期終點。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，初始美國紅魚片為一級新鮮度，隨著儲藏時間的延長，對照組的細(xì)菌總數(shù)在第8天時為6.17(lg(CFU/g))，已經(jīng)超過國家規(guī)定的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。而經(jīng)過殼聚糖溶液涂膜處理的美國紅魚片細(xì)菌總數(shù)增長幅度低于對照組，根據(jù)1.0、1.5、2.0、3.0g/100mL殼聚糖處理后的細(xì)菌總數(shù)與貯藏時間的線性關(guān)系可知，它們分別于第11、13、14、13天時達(dá)到了6.0(lg(CFU/g))，超過了可食用標(biāo)準(zhǔn)。這說明貯藏過程中殼聚糖具有明顯的抑菌效果，能夠使魚肉中腐敗菌的生長受到抑制，保證了魚肉的品質(zhì)。整個貯藏過程中，2.0g/100mL組的抑菌效果最好，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度超過2.0g/100mL時，殼聚糖抑菌能力下降，這可能是由于殼聚糖質(zhì)量濃度大、黏度過高而降低了其對細(xì)菌的抑制作用[12]。該結(jié)果與楊勝平等[13]采用不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜帶魚測定的細(xì)菌總數(shù)結(jié)果相似。

圖 1 殼聚糖涂膜對冷藏美國紅魚片細(xì)菌總數(shù)的影響Fig.1 Effect of chitosan coating on TVC of red drum fillets stored at 4 ℃

2.3 不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜對美國紅魚片pH值的影響

圖 2 殼聚糖涂膜對冷藏美國紅魚片pH值的影響Fig.2 Effect of chitosan coating on pH of red drum fillets stored at 4 ℃

動物肌肉的pH值變化與其鮮度密切相關(guān)，測定魚肌肉pH值變化可以作為判定其鮮度的參考指標(biāo)之一，通常而言，水產(chǎn)動物停止呼吸后，體內(nèi)的糖原被降解，生成乳酸等酸類物質(zhì)，造成肌肉pH值的下降，下降程度與肌肉中糖原的含量有關(guān)。隨后在自身酶和微生物的作用下[14]，魚體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸及其他含氮物質(zhì)被分解為氨、三甲胺、吲哚、組胺等堿性物質(zhì)，使得肌肉pH值上升，因此肌肉的pH值變化趨勢一般呈V字型。由圖2可知，5組初始pH值為6.78，相互之間的pH值差別不大，說明殼聚糖處理并不影響魚肉的初始pH值。5組的pH值在貯藏的前4d呈現(xiàn)明顯的降低趨勢，可能是因為魚體死后迅速進入僵直階段，其肌肉中的糖原經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸，而使其肌肉pH值下降。隨后5組的pH值都開始增加，對照組增加最為迅速，而殼聚糖處理后的4組的pH值增加相對緩慢。從整體上看，殼聚糖處理組中2.0g/100mL處理組pH值上升趨勢平緩，且明顯低于對照組(P＜0.05)。這與微生物測定結(jié)果相吻合，說明2.0g/100mL殼聚糖能夠較好地保持美國紅魚的品質(zhì)。

2.4 不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜對美國紅魚片TBA值的影響

TBA(硫代巴比妥酸)值與肉類脂肪氧化程度有很強的相關(guān)性，TBA值越大，說明脂肪的氧化程度越高，酸敗就越嚴(yán)重，產(chǎn)生的小分子物質(zhì)(醛、酮、酸等)越多，因此是廣泛用于水產(chǎn)品、肉品品質(zhì)評價中反應(yīng)脂類氧化的一個常用指標(biāo)[15]。它的反應(yīng)原理是根據(jù)脂肪酸氧化降解產(chǎn)物丙二醛與TBA試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色化合物。不同質(zhì)量濃度殼聚糖處理的美國紅魚冷藏過程中TBA值變化如表2所示。美國紅魚初始的TBA值很低，僅有0.072mg MDA/kg，貯藏期前4d時，5組樣品的TBA值均略有升高，但之后其TBA值變化無顯著差異(P＞0.05)，表現(xiàn)出無規(guī)律性。這可能是因為一方面美國紅魚的脂肪含量極低(僅為0.71%)，脂肪氧化反應(yīng)不明顯；另一方面也可能是因為脂肪氧化產(chǎn)物MDA還可以與核苷、核酸、蛋白質(zhì)、磷脂氨基酸以及脂肪氧化的終產(chǎn)物醛類反應(yīng)，從而使得MDA的量不能累積上升[16]。

表2 美國紅魚片在4℃貯藏過程中TBA值的變化Table 2 Changes in thiobarbituric acid (TBA) of red drum fillets during cold storage at 4 ℃mg MDA/kg

2.5 不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜對美國紅魚片TVB-N含量的影響

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是指動物性食品在細(xì)菌和酶的作用下，分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)。在許多肉類和魚類中TVB-N水平和鮮度感官評定之間有很高的相關(guān)性，因此TVB-N被廣泛作為反映肉類和魚類腐敗程度的最重要指標(biāo)之一，已被我國和大多數(shù)國家作為鑒定肉類和水產(chǎn)品腐敗程度的標(biāo)準(zhǔn)，30mg/100g被認(rèn)為是水產(chǎn)品品質(zhì)可被消費者接受的TVB-N上限[17]。不同質(zhì)量濃度殼聚糖處理對美國紅魚TVB-N值的影響如圖3所示。貯藏的前8d，5組TVB-N含量相互之間基本無差別，且都屬于一級新鮮度的范疇。到第8天后，TVB-N含量開始迅速上升，在第16天時，除了2.0g/100mL殼聚糖處理組之外，其他4組的TVB-N含量都超過了可被接受的上限。經(jīng)過顯著性差異分析得到，經(jīng)過殼聚糖處理的美國紅魚，2.0g/100mL殼聚糖處理組的TVB-N含量明顯低于對照組(P＜0.05)，其TVB-N含量變化與細(xì)菌總數(shù)變化等有較好的相關(guān)性，說明適宜質(zhì)量濃度的殼聚糖能有效抑制細(xì)菌的生長，從而降低細(xì)菌對蛋白質(zhì)的分解，達(dá)到減緩TVB-N含量上升的作用。

圖 3 殼聚糖涂膜對冷藏美國紅魚片TVB-N值的影響Fig.3 Effect of chitosan coating on TVB-N of red drum fillets stored at 4 ℃

2.6 不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜對美國紅魚片K值的影響

K值為肌苷(HxR)和次黃嘌呤(Hx)的含量總和與腺嘌呤核苷(ATP)代謝的含量總和的比值，一般鮮魚肌肉的ATP含量為4～9μmol/g，死后ATP迅速分解成IMP、HxR和Hx。ATP降解速率與品種、死后時間、貯藏溫度、運輸條件和殺死方法有關(guān)[18]。K值越小就表示魚的鮮度越好，K值越大則鮮度越差。從圖4可以看出，隨著冷藏時間的延長，K值呈現(xiàn)上升的趨勢，其中上升最快的是對照組，最慢的是以2.0g/100mL殼聚糖涂膜處理的美國紅魚片。可見2.0g/100mL的殼聚糖能夠有效的抑制ATP分解，從而有效延長美國紅魚低溫貯藏的貨架期。

圖 4 殼聚糖涂膜對冷藏美國紅魚片K值的影響Fig.4 Effect of chitosan coating on K value of red drum fillets stored at 4 ℃

2.7 不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜對美國紅魚片質(zhì)構(gòu)的影響

魚類等水產(chǎn)品在死后由于自身降解和微生物作用，使其鮮度降低并發(fā)生腐敗，同時會引起肌肉組織結(jié)構(gòu)的變化以及質(zhì)構(gòu)特性的變化，最終導(dǎo)致水產(chǎn)品肌體變軟，彈性下降。質(zhì)構(gòu)特性包括硬度(hardness)、彈性(springiness)、咀嚼性(chewiness)、黏著性(adhesiveness)、凝聚性(cohesiveness)、膠性(gumminess)和回復(fù)性(resilience)等，是反映水產(chǎn)品品質(zhì)的一個重要屬性[19-20]。貯藏過程中各組處理樣品質(zhì)構(gòu)特性(硬度、彈性和咀嚼性)的變化如表3所示?？梢钥闯鲭S著貯藏時間延長，各組樣品的硬度呈現(xiàn)先增加而后開始下降，主要由于魚體死后，體內(nèi)糖原在無氧條件下產(chǎn)生乳酸，肌肉中ATP含量急劇下降而使肌肉收縮導(dǎo)致僵硬，當(dāng)ATP消耗完全消失，魚體變得最硬，肌肉僵硬結(jié)束，開始重新變軟，進入“自溶”階段。所以其硬度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。對于對照組，處理組的硬度下降趨勢較平緩，且殼聚糖質(zhì)量濃度為2.0g/100mL的硬度較好，同時從表3可以看出殼聚糖涂膜的美國紅魚的彈性及咀嚼性均優(yōu)于對照組。表明適當(dāng)質(zhì)量濃度的殼聚糖涂膜能夠有效抑制細(xì)菌增長，減緩魚的氧化變質(zhì)，保持和改善美國紅魚的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

表3 殼聚糖涂膜對冷藏美國紅魚片質(zhì)構(gòu)的影響Table 3 Changes in texture of red drum fillets stored at 4℃ by chitosan coating

2.8 不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜對美國紅魚片感官評分的影響

圖 5 殼聚糖涂膜對冷藏美國紅魚片感官評分的影響Fig.5 Effect of chitosan coating on sensory scores of red drum fillets stored at 4 ℃

不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜對美國紅魚片感官的影響如圖5所示。可以看出，隨著貯藏時間的延長，紅魚片的感官評分逐漸下降。在實驗開始時，所有實驗組和對照組的評分都為10分，隨著貯藏時間的延長，對照組的紅魚片感官評分明顯下降，表現(xiàn)出肌肉組織松散，彈性變差，肉質(zhì)黏稠，并帶有臭味，其分值明顯低于殼聚糖涂膜處理組。不同質(zhì)量濃度殼聚糖涂膜的處理組感官評分也一直呈現(xiàn)下降趨勢，質(zhì)量濃度為2.0g/100mL的殼聚糖涂膜的美國紅魚片分值一直高于其他處理組。由此表明，殼聚糖涂膜能夠有效抑制冷藏過程中美國紅魚片體內(nèi)微生物的生長繁殖速度，從而較好的保持了其感官品質(zhì)。

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，經(jīng)過殼聚糖涂膜的美國紅魚片在冷藏過程，其細(xì)菌總數(shù)、pH值、TBA值、TVB-N含量和K值等指標(biāo)明顯低于對照組，感官評分也具有較好的效果。且當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度為2.0g/100mL時，能較好地抑制細(xì)菌生長，減緩蛋白質(zhì)分解和脂肪氧化的速度，有效延長美國紅魚片貨架期4～6d，因此殼聚糖涂膜在美國紅魚片的冷藏保鮮中具有良好的應(yīng)用前景。

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