鐘賽意，劉壽春，秦小明,*，王維民，林華娟，諶素華

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524005；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)信息技術(shù)研究中心，北京 100097)

生物胺是一類具有生物活性的低分子量有機(jī)含氮化合物，廣泛存在于富含蛋白質(zhì)和氨基酸的水產(chǎn)品、肉制品、干酪、酒類等食品中。適量的生物胺能有效調(diào)節(jié)生物體的生理代謝功能，但過(guò)量攝入則會(huì)導(dǎo)致人體產(chǎn)生血壓升高、頭痛、皮疹、腫脹、腹瀉、嘔吐等中毒癥狀[1]。除了天然胺類，食品中的生物胺主要由微生物產(chǎn)生脫羧酶催化氨基酸脫羧作用生成。生物胺的生成與食品自身特性、微生物菌群以及加工貯藏條件有關(guān)，進(jìn)而影響其前體物質(zhì)氨基酸的含量以及脫羧酶的活性[2]。目前，已有一些關(guān)于金槍魚(yú)、三文魚(yú)、大西洋青魚(yú)、沙丁魚(yú)、雀鱔魚(yú)等海水魚(yú)中生物胺生成情況的研究[3-7]，生物胺(尤其是組胺和酪胺)已經(jīng)被歐美國(guó)家建議列入海產(chǎn)品的安全限量攝入[8]，然而很少關(guān)于淡水魚(yú)中生物胺的研究。羅非魚(yú)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)種，其肉厚刺少風(fēng)味佳，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎。冷鮮羅非魚(yú)在加工貯運(yùn)過(guò)程中難免遭受微生物污染并代謝產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)——生物胺，其生物胺的生成情況與微生物生長(zhǎng)的相互關(guān)系有待研究。

本研究以冷藏真空包裝羅非魚(yú)為研究對(duì)象，檢測(cè)其常見(jiàn)主要生物胺的含量，同時(shí)測(cè)定微生物及其他品質(zhì)指標(biāo)的變化，建立生物胺與微生物生長(zhǎng)的相互關(guān)系和回歸方程，為今后基于生物胺變化預(yù)測(cè)安全食用貨架期提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

厭氧菌瓊脂、發(fā)光菌瓊脂、MRS瓊脂 青島海博生物技術(shù)有限公司；STAA瓊脂 英國(guó)Oxoid公司；乙腈、丙酮、高氯酸 北京藍(lán)弋生化試劑有限公司；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JG21002電子天平 上海天平儀器廠；KDY-9820凱氏定氮儀 北京通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；LC-10 AT液相色譜儀 日本島津公司；C18-Diamondsil(25cm × 4.6mm，5μm)反相色譜柱 迪馬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 貯藏實(shí)驗(yàn)

鮮活淡水羅非魚(yú)擊殺加工成生鮮魚(yú)片，清洗，濾水晾干，每片魚(yú)片獨(dú)立真空包裝后放置于保溫箱中，一層魚(yú)一層冰確保低溫運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室；抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，去除冰塊，將包裝好的魚(yú)片放置于(5.13 ± 0.51)℃冰箱中貯藏。貯藏過(guò)程每隔一段時(shí)間隨機(jī)取3片魚(yú)片進(jìn)行分析。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 生物胺測(cè)定

生物胺采用反相高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定，按照Kim等[9]方法略作修改：準(zhǔn)確稱5g混勻肉樣，加15mL 預(yù)冷的0.6mol/L高氯酸，均質(zhì)后高速低溫離心15min，取上清液；重復(fù)操作1次，合并2次上清液并定容。取1mL樣液，依次加入200μL 2mol/L NaOH、300μL飽和碳酸氫鈉溶液和2mL丹磺酰氯，40℃避光反應(yīng)45min。然后加入100μL氨水，靜置30min，用乙腈定容至5mL，混勻，3000r/min離心10min，有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，濾液直接測(cè)定或于－20℃貯存?zhèn)溆谩z測(cè)條件：流動(dòng)相為0.1mol/L醋酸銨和乙腈，流速0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣量10μL。采用外標(biāo)法測(cè)定各種生物胺的含量。

單胺=色胺＋苯乙胺＋組胺＋酪胺；二胺=腐胺＋尸胺；多胺=精胺＋亞精胺；總生物胺=色胺＋苯乙胺＋組胺＋酪胺＋腐胺＋尸胺＋精胺＋亞精胺。生物胺指數(shù)(biogenic amine index，BAI)=組胺＋腐胺＋尸胺＋酪胺；質(zhì)量指數(shù)(quality index，QI)=(組胺＋腐胺＋尸胺/(1＋亞精胺＋精胺)。

1.3.2.2 微生物測(cè)定

無(wú)菌操作稱25g魚(yú)肉置于225mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩均勻，做10倍系列稀釋，選取適宜稀釋度接種于選擇性培養(yǎng)基。厭氧菌采用厭氧菌瓊脂，接種于厭氧管中，30℃培養(yǎng)48h；乳酸菌接種于MRS瓊脂，30℃培養(yǎng)72h；明亮發(fā)光桿菌采用發(fā)光菌分離培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)48h；熱殺索絲菌采用STAA瓊脂于25℃培養(yǎng)48h。計(jì)算典型菌落，換算成對(duì)數(shù)值(lgCFU/g)。

1.3.2.3 三甲胺氮測(cè)定

三甲胺氮(trimethylamine-nitrogen，TMAN)測(cè)定參考Malle等[10]方法進(jìn)行：準(zhǔn)確稱10g混合肉樣，加90mL預(yù)冷的0.6mol/L高氯酸，均質(zhì)，低溫靜置30min，3000r/min離心15min，過(guò)濾，取5mL濾液，加入10mL濃甲醛，置于半自動(dòng)凱氏定氮儀中蒸餾6min，甲醛能與一級(jí)和二級(jí)胺反應(yīng)生成六亞甲基亞胺，游離的三甲胺被蒸餾出來(lái)，接收液中則是三甲胺的含量，采用0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至中性，通過(guò)鹽酸溶液用量換算TMAN含量。

1.3.2.4 酸度測(cè)定

酸度的測(cè)定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》酸堿滴定法。

2 結(jié)果與分析

2.1 真空包裝羅非魚(yú)貯藏過(guò)程主要生物胺的變化

圖 1 羅非魚(yú)貯藏過(guò)程主要生物胺的變化Fig.1 Changes of major biogenic amine during storage

由圖1可知，8種生物胺中，色胺和酪胺的檢出質(zhì)量濃度很低，其始末含量分別為1.00～5.23mg/kg和1.55～14.47mg/kg，15d以前兩者含量均小于3mg/kg，至19d兩者檢出量開(kāi)始增加并達(dá)到最大值5.23mg/kg和 14.47mg/kg。貯藏過(guò)程中，苯乙胺的檢出量在第4天出現(xiàn)一個(gè)峰值高達(dá)19.42mg/kg，其他時(shí)期均小于7mg/kg。雖然上述3者含量在8種生物胺中含量不高，可能與其前體物質(zhì)色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸在魚(yú)體中的含量有關(guān)[1]，但總體呈現(xiàn)波動(dòng)的上升趨勢(shì)。組胺在生物胺中毒性最大，4d以前，組胺含量小于3mg/kg，隨后呈現(xiàn)直線快速增加趨勢(shì)，第8天增加至25.24mg/kg，比初始值高出11倍，且含量持續(xù)增加至貯藏末期92.84mg/kg。組胺主要由組氨酸脫胺作用生成，但一般生鮮羅非魚(yú)肌肉中組氨酸含量并不算太高，不是主要氨基酸[11]，因此，組胺的生成可能與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生更多的組氨酸前體物質(zhì)有關(guān)。

在貯藏中后期(8～19d)，8種生物胺中腐胺占據(jù)最高含量，尸胺次之。腐胺和尸胺初始含量并不高，4d以前，分別為4.74～5.61mg/kg和0.73～0.82mg/kg，尸胺含量最低；4～8d，腐胺含量迅速增加至134.92mg/kg，尸胺也增加至19.92mg/kg，比初始值分別增加了28倍和20倍，此期間生物胺的生成反應(yīng)迅速進(jìn)行。至第15天，兩者含量達(dá)到貯藏期最大值，分別為240.31mg/kg和112.94mg/kg，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。從整個(gè)貯藏過(guò)程8種生物胺的變化情況來(lái)看，腐胺和尸胺的變化起著主導(dǎo)作用，次之為組胺，即三者為主要生物胺。

8種生物胺中，初始含量最高為精胺和亞精胺，分別為10.09mg/kg和8.09mg/kg，亞精胺在貯藏過(guò)程呈現(xiàn)先輕微上升后逐漸下降的趨勢(shì)，而精胺呈現(xiàn)先下降后逐漸回升，兩者終含量分別為5.32mg/kg和9.44mg/kg，均低于初始含量。精胺和亞精胺的含量在魚(yú)體中普遍含量較高[12]，且研究表明包裝和貯藏溫度對(duì)亞精胺含量影響不明顯[13]。因此，精胺和亞精胺不能很好地反映魚(yú)肉的品質(zhì)變化。同樣，本研究結(jié)果表明，精胺和亞精胺的變化與貯藏時(shí)間沒(méi)有良好相關(guān)性。

2.2 真空包裝羅非魚(yú)貯藏過(guò)程不同生物胺種類及總生物胺的變化

生物胺是一類具有生物活性的低分子質(zhì)量非揮發(fā)性的有機(jī)含氮化合物，按其合成途徑可分成單胺(酪胺、苯乙胺、組胺、色胺)、二胺(腐胺、尸胺)和多胺(精胺、亞精胺)[2]。就其毒性而言，單胺中的組胺的毒性最大，酪胺次之；二胺中的腐胺和尸胺會(huì)增強(qiáng)組胺和酪胺的毒性[1]，精胺和亞精胺作為生理多胺，對(duì)生物體內(nèi)的代謝具有機(jī)能性作用。由圖2可知，多胺的含量總體呈下降趨勢(shì)，從初始18.88mg/kg下降至19d的14.76mg/kg，其變化對(duì)魚(yú)肉的貯藏時(shí)間沒(méi)有顯著影響；單胺的含量呈平緩的直線上升趨勢(shì)，從初始9.87mg/kg上升至19d的117.17mg/kg，其主要原因是組胺含量在持續(xù)增加；二胺含量顯著高于單胺和多胺，從初始5.47mg/kg增加至263.13mg/kg，并主導(dǎo)著總生物胺的變化趨勢(shì)；總生物胺與二胺的變化趨勢(shì)基本一致，只在總量上比二胺高，總生物胺從初始34.21mg/kg增加至末期395.06mg/kg；其中單胺和總生物胺的始末含量增加了近12倍，而二胺始末含量增長(zhǎng)了48倍，可見(jiàn)二胺是貯藏過(guò)程的優(yōu)勢(shì)生物胺。

2.3 真空包裝羅非魚(yú)貯藏過(guò)程生物胺指標(biāo)的變化

圖 3 羅非魚(yú)貯藏過(guò)程生物胺指標(biāo)的變化Fig.3 Change of biogenic amine indicators during storage

腐胺、尸胺和組胺是本研究真空包裝羅非魚(yú)的主要生物胺，也是衡量其他水產(chǎn)品質(zhì)量安全的主要標(biāo)準(zhǔn)[14]。Veciana-Nogués等[15]提出BAI和QI的限值評(píng)價(jià)金槍魚(yú)的感官可接受性，但兩者的限值隨著貯藏溫度的升高而升高。?zogul等[6]研究表明氣調(diào)和真空包裝沙丁魚(yú)的BAI和QI與貯藏時(shí)間及感官可接受性具有良好的相關(guān)性。如圖3所示，BAI和QI均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)增加，其變化曲線與二胺及總生物胺相似，即先上升后下降。4d以前，BAI(10.05～10.54mg/kg)和QI(0.39～0.47)沒(méi)有明顯變化，4d以后，二者快速增加，表明4～8d之間有明顯的變化拐點(diǎn)。由于腐胺、尸胺、組胺是主要生物胺，因此涵蓋其三者的BAI與總生物胺總量非常相近；BAI在一定程度上可以代替總生物胺，尤其在貯藏中后期(8～19d)。Mieltz等[13]建議QI=10是金槍魚(yú)的可接受限值，根據(jù)該限值，真空包裝羅非魚(yú)的可接受期為貯藏8～11d(QI=9.22～16.94)。

2.4 真空包裝羅非魚(yú)貯藏過(guò)程揮發(fā)性含氮化合物的變化

圖 4 羅非魚(yú)貯藏過(guò)程TMAN和酸度的變化Fig.4 Change of TMAN and acidity during storage

TMAN是魚(yú)肉中的鮮味物質(zhì)氧化三甲胺在厭氧菌的分解還原作用下產(chǎn)生帶有揮發(fā)性與腥臭味的含氮化合物，TMAN含量越高，魚(yú)的新鮮度越差[16]。鮮活淡水魚(yú)中一般不含TMAN，但冷藏1d就能檢出，其含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)和魚(yú)肉新鮮度下降而逐漸增加，與感官評(píng)分、貯藏時(shí)間具有高度相關(guān)性[17-18]。有學(xué)者建議淡水魚(yú)TMAN含量應(yīng)不高于60mg/100g，海水魚(yú)應(yīng)不高于390mg/100g，否則視為腐敗[19]；本研究結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該限值。如圖4所示，初始TMAN為2.55mg/100g，0～8d TMAN增加有個(gè)較長(zhǎng)的延滯期(含量均＜3mg/100g)，第8天是TMAN變化的重要拐點(diǎn)，隨后開(kāi)始增加至19d的4.43mg/100g。一般認(rèn)為魚(yú)肉中TMAN的可接受范圍為10～15mg/100g，但魚(yú)肉初期腐敗的臨界值因魚(yú)種不同存在差異，本研究結(jié)果與蔡慧農(nóng)等[18]較為接近，但明顯低于其他研究結(jié)果[17,19-20]，可能與包裝方式和貯藏溫度有關(guān)。

由于密閉環(huán)境的真空包裝容易使肉中產(chǎn)生乳酸和碳酸，因此包裝內(nèi)魚(yú)肉會(huì)產(chǎn)生一種發(fā)酸的異味。通過(guò)測(cè)定酸度來(lái)反映真空包裝中魚(yú)肉酸化和肉質(zhì)劣變的情況，本研究的滴定酸度以乳酸為主。如圖4所示，初始酸度為2.95g/kg，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，酸度逐漸增加，在15d有輕微的下降，但總體呈線性增加，最終酸度到達(dá)9.45g/kg?？梢?jiàn)真空包裝魚(yú)肉的揮發(fā)酸味和肉質(zhì)軟化與酸度增加存在一定關(guān)系。

2.5 真空包裝羅非魚(yú)主要微生物菌群的生長(zhǎng)情況

圖 5 羅非魚(yú)貯藏過(guò)程主要微生物菌群變化Fig.5 Change of major microflora during storage

厭氧菌為厭氧滾管中生長(zhǎng)的所有厭氧及兼性厭氧的微生物數(shù)量，明亮發(fā)光桿菌是真空和氣調(diào)包裝水產(chǎn)品中的重要革蘭氏陰性菌，乳酸菌和熱殺索絲菌是兼性厭氧或微氧條件下的主要革蘭氏陽(yáng)性菌，并能在真空和氣調(diào)包裝中選擇性生長(zhǎng)，對(duì)魚(yú)肉中氨基酸脫羧作用生成生物胺具有重要作用[2,6]。如圖5所示，厭氧菌與明亮發(fā)光桿菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)非常相近，多個(gè)時(shí)期處于曲線重合狀態(tài)，在貯藏中后期(8～19d)，兩者數(shù)量均高于乳酸菌和熱殺索絲菌約2(lg(CFU/g))，而乳酸菌數(shù)量高于熱殺索絲菌；微生物菌群的數(shù)量高低依次為：厭氧菌＞明亮發(fā)光桿菌＞乳酸菌＞熱殺索絲菌。表明在兼性厭氧條件下，厭氧菌和明亮發(fā)光桿菌能夠更好地生長(zhǎng)，兩者分別從初始2.99(lg(CFU/g))和3.26(lg(CFU/g))持續(xù)增加至15d最大值9.09(lg(CFU/g))和8.66(lg(CFU/g))，在19d回落至8.25(lg(CFU/g))和8.33(lg(CFU/g))。乳酸菌和熱殺索絲菌的生長(zhǎng)速度相對(duì)平緩，整個(gè)貯藏過(guò)程乳酸菌不超過(guò)7.5(lg(CFU/g))，熱殺索絲菌不超過(guò)6.5(lg(CFU/g))。4類微生物在數(shù)量上雖然有差別，但沒(méi)有明顯延滯期，且快速生長(zhǎng)期均出現(xiàn)在0～4d，第8天開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期。從數(shù)量上看，厭氧菌和明亮發(fā)光桿菌最終均超過(guò)8(lg(CFU/g))，而乳酸菌和熱殺索絲菌也達(dá)到6～7(lg(CFU/g))，因此不能忽視其在真空包裝魚(yú)肉中的生長(zhǎng)及其腐敗代謝作用。

2.6 真空包裝羅非魚(yú)生物胺生成與微生物生長(zhǎng)的相關(guān)性

表1 生物胺與微生物生長(zhǎng)的相關(guān)性Table 1 Correlation between biogenic amines and microbial growth

從表1可看出，微生物生長(zhǎng)與貯藏時(shí)間呈高度相關(guān)性(r=0.829～0.865)；生物胺指標(biāo)(除了色胺、苯乙胺、酪胺、精胺)與貯藏時(shí)間也高度相關(guān)(r=0.799～0.968)，其中組胺相關(guān)性最高，次之為QI；TMAN、酸度與貯藏時(shí)間也高度正相關(guān)(r=0.897～0.899)。8種單個(gè)生物胺中，腐胺與4種微生物生長(zhǎng)的相關(guān)性最高(r=0.814～0.887)，次之為尸胺(r=0.675～0.762)，組胺位居第三(r=0.678～0.776)；色胺、苯乙胺、酪胺、亞精胺、精胺與微生物生長(zhǎng)沒(méi)有相關(guān)性。其他生物胺指標(biāo)與微生物生長(zhǎng)的相關(guān)性高低順序?yàn)椋嚎偵锇罚径罚綛AI＞QI＞多胺；由于總生物胺中包含了8種生物胺，因此，二胺、BAI的應(yīng)用性可能更簡(jiǎn)便。酸度與微生物生長(zhǎng)的相關(guān)性高于上述任何生物胺指標(biāo)(r=0.893～0.973)，表明魚(yú)肉中酸度的增加與微生物生長(zhǎng)關(guān)系密切。

2.7 生物胺生成與微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)魚(yú)肉品質(zhì)變化

根據(jù)表1中生物胺與貯藏時(shí)間、微生物、TMAN以及酸度的相關(guān)性獲得的主要結(jié)果，采用逐步回歸分析對(duì)上述指標(biāo)全部選入進(jìn)行篩選擬合，以貯藏時(shí)間為因變量，其他指標(biāo)為自變量，根據(jù)顯著性大小逐步進(jìn)入模型中，擬合標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)，進(jìn)而獲得模型的指標(biāo)、擬合度以及誤差等參數(shù)，見(jiàn)表2。最終共有5個(gè)指標(biāo)進(jìn)入模型中，其顯著性高低順序依次為：組胺、厭氧菌、尸胺、單胺和BAI；其中組胺的線性回歸判定系數(shù)已達(dá)到0.936，即組胺1個(gè)變量對(duì)于貯藏時(shí)間函數(shù)的解釋能力為93.6%，綜合其他4個(gè)指標(biāo)能達(dá)到100%的解釋能力，且標(biāo)準(zhǔn)誤差均小于2.0，方程P值均為0.000(極顯著)，表明回歸方程的擬合度非常好?？紤]到本研究中優(yōu)勢(shì)生物胺(腐胺、尸胺、組胺)與微生物的指數(shù)生長(zhǎng)具有高度相關(guān)性，見(jiàn)表1，且線性回歸方程不能完整地反映某些指標(biāo)的非線性變化，因此，使用多元線性回歸模型，其預(yù)測(cè)精度和有效性要高于一元線性回歸方程，因此表2中的方程3可能更適用于本研究結(jié)果。另外，因變量(y)的選擇是影響預(yù)測(cè)模型有效性的關(guān)鍵因素，具體因變量的選擇以及預(yù)測(cè)模型精度有待更深入的研究和驗(yàn)證。

表2 真空包裝羅非魚(yú)多指標(biāo)的逐步回歸分析Table 2 Stepwise regression analysis of indicators in vacuum-packed tilapia

3 結(jié) 論

真空包裝羅非魚(yú)冷藏過(guò)程中，腐胺、尸胺、組胺是優(yōu)勢(shì)生物胺；二胺和BAI能有效反映總生物胺的變化；厭氧菌和明亮發(fā)光桿菌生長(zhǎng)良好，最高數(shù)量超過(guò)8.0(lg(CFU/g))；色胺、苯乙胺、酪胺、亞精胺、精胺與微生物生長(zhǎng)不相關(guān)，其他生物胺指標(biāo)與微生物生長(zhǎng)具有良好相關(guān)性；二胺和BAI作為生物胺評(píng)價(jià)指標(biāo)的應(yīng)用性可能更簡(jiǎn)便；通過(guò)多指標(biāo)逐步回歸分析獲得良好擬合度的多元線性回歸方程：貯藏時(shí)間(y)=0.125×組胺＋0.941×厭氧菌＋0.022×尸胺－2.918。

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