陳保華，毛 英，黃 榮，高 毅

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

目前，世界上廣泛采用的組織器官灌注保存液為UW(University of Wisconsin)液，它可有效地保存肝臟24～30 h，然而UW液也存在著不足，如價格昂貴等。我國上海研制并已廣泛運用于國內腎移植灌洗保存的高滲枸櫞酸鹽嘌呤(HCA)液，雖具有配方簡便，價格合理的優(yōu)點，但用于移植肝的灌洗保存效果與UW液仍有較大差距。本實驗旨在通過用漢防己甲素(TET)乳酸林格液、TET-HCA液、HCA液和UW液低溫灌洗保存供肝2 h的實驗，比較TETHCA液與UW液對供肝的保護作用，并分析TET對HCA液的優(yōu)化效果。

1 材料與方法

1.1 材料 采用成年健康SD大鼠80只，雌雄不拘，體重(250±10)g，由中科院實驗動物中心提供，等級SPF〔合格證號 NO：0034376，許可證號 SCXK(滬)2009-0006〕，隨機分成4組。試劑有TET(江西銀濤藥業(yè)有限公司生產(chǎn))、HCA液(上海輸血技術有限公司生產(chǎn))、UW液(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院提供)、乳酸林格液、ATP、ADP、AMP標準品(南京華東醫(yī)藥公司提供)，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑、乳酸脫氫酶(LDH)試劑(上海長征試劑公司產(chǎn)品)。主要儀器有Waters1275型高效液相色譜儀(美國沃斯特公司)、HITACHI7150型全自動生化分析儀(日本日立公司)、常規(guī)配制TET/乳酸林格液(60 mg/L)、TET/HCA液(60 mg/L)等。

1.2 方法

1.2.1 分組 將80只SD大鼠隨機分成4組。A組(TET乳酸林格液組)以4℃ TET乳酸林格液(70 mg/L)進行供肝灌洗再以該液保存。B組(HCA液組)以4℃ HCA液進行供肝灌洗再以該液保存。C組(TET-HCA液組)以4℃ TET-HCA液(60 mg/L)進行供肝灌洗再以該液保存。D組(UW液組)以4℃UW液進行供肝灌洗再以該液保存。每組灌洗液均為40 ml，低溫保存時間均為2 h。

1.2.2 處理方法 實驗前12 h動物禁食，自由進水，乙醚麻醉后取仰臥位，腹部弧形切口，順時針分離肝下腔靜脈、右腎靜脈、右三角韌帶及鐮狀韌帶，結扎左膈靜脈，肝動脈結扎離斷，游離出門靜脈遠端并予結扎，然后經(jīng)門靜脈插管并以持續(xù)滴注法將4℃的各保存液行供肝原位低壓重力灌洗。同時剪開肝下腔靜脈，邊灌注邊放血，至肝顏色變淡呈均勻土黃色，即于4℃的各保存液中保存2 h。

1.3 標本收集及測試方法

1.3.1 ALT及LDH檢測 分別取各組的保存液2 ml進行檢測。取保存液前，用注射器抽取5 ml保存液，緩慢沖洗肝臟，然后將保存液搖勻取樣。應用全自動生化分析儀檢測ALT與LDH。

1.3.2 肝組織中ATP、ADP、AMP含量測定 標本處理：各組大鼠均取肝組織約1 g液氮中保存。標本從液氮中取出后，迅速稱取500 mg，置于1 ml 0.4 mol/L HClO4溶液中研磨5～8 min(冰溶)，低溫離心(離心半徑8 cm，10000 r/min)15 min，取上清液；用0.6 mol/L KOH中和使pH值為7.0，再次低溫離心(離心半徑8 cm，10000 r/min)15 min，取上清液于-30℃下保存，2周內檢測。采用waters1275型高效液相色譜檢測高能磷酸化合物，應用C18分析柱，磷酸鹽緩沖液為流動相(pH=6.0)，檢測波長254 nm，流速 1.0 ml/min，進樣 10μl，柱溫 23 ℃。本實驗采用Athinson能量價(energy charge，EC)公式［EC=(ATP+1/2ADP)/(ATP+ADP+AMP)］評價各組組織的能量消耗。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有結果均采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

A組與B組ATP及EC值無明顯差異(P＞0.05)，提示用TET乳酸林格液低溫灌洗并保存鼠肝2 h，在減少供肝低溫灌注保存中肝細胞能量的消耗，保持供肝細胞的活性方面具有與HCA液相當?shù)男Ч?。C組肝細胞的ATP及EC值顯著比B組高，具有顯著性差異(P＜0.05)，提示用TET-HCA液低溫灌洗保存供肝2 h比以HCA液灌洗保存供肝2 h，在減少供肝低溫灌注保存中肝細胞能量的消耗，保持供肝細胞的活性方面具有更好的效果。C組與D組中ATP及EC值無明顯差異(P＞0.05)，提示用TET+HCA液低溫灌洗保存鼠肝2 h，在減少供肝低溫灌注保存中肝細胞能量的消耗，保持供肝細胞的活性方面具有與UW液相當?shù)男Ч?表1)。A、B兩組保存液中ALT、LDH比較無顯著差異(P＞0.05)，說明用TET乳酸林格液低溫灌洗并保存鼠肝2h，在供肝低溫灌注保存減少肝細胞損害方面具有與HCA液類似的效果。C組肝細胞ALT及LDH檢測值顯著較B組低，具有顯著性差異(P＜0.05)，提示用TET-HCA液低溫灌洗保存供肝2 h比以HCA液灌洗保存供肝2 h，在供肝低溫灌注保存減輕肝細胞損害方面具有更好的效果。C、D兩組ALT、LDH比較無顯著差異(P＞0.05)，表明用TETHCA液低溫灌洗保存鼠肝2 h，在供肝低溫灌注保存減少肝細胞損害方面具有與UW液相同的效果(表2)。

3 討論

供肝保存是肝移植成功的先決條件，目前常用供肝保存液中，UW液使肝臟保存由原來的6～8 h延長至24～30 h，成為目前應用最廣的肝、腎、胰臟的“金標準”保存液［1］，該保存液基本可防止細胞的水腫、細胞內的酸中毒、間質水腫及氧自由基的損傷，促進了高能化合物的再生。但它也有諸如黏度高、價格昂貴、處理與檢測不便等缺點。

本研究表明，TET在低溫灌洗保存條件下減輕肝細胞的損害，直接用于供肝低溫灌注保存對大鼠肝臟具有良好的保護作用。推測TET應用于配制供肝保存液可能有較好的效果。

本實驗表明，用自行配制的TET乳酸林格液低溫灌洗并保存鼠肝2 h，在供肝低溫灌注保存中可減少肝細胞能量的消耗，保持供肝細胞的活性，在減輕肝細胞損害方面具有與HCA液相當?shù)男Ч?。HCA液是一不含Ca2+拮抗劑的仿細胞內保存液，其主要作用為溶液的高滲性防止了細胞的水腫；而TET主要是通過細胞內Ca2+拮抗作用而保護供肝［2-4］。本研究中兩者均具有相同的保存效果，推測供肝在低溫灌注保存中的損傷原因及保護機制可能亦具有多樣性。注：與B組比較，*P＜0.05

表1 各組肝組織中高能磷酸化合物含量比較(nmol/g，)

表1 各組肝組織中高能磷酸化合物含量比較(nmol/g，)

組別 n ADP AMP ATP EC(值)A組 20 1.242±0.155 0.943±0.100 1.346±0.199 0.571±0.1070±0.110 C組 20 1.834±0.220 0.685±0.103 1.988±0.212* 0.871±0.120*B組 20 1.370±0.210 0.917±0.121 1.485±0.241 0.612±0.104 D組 20 1.885±0.289 0.621±0.102 2.043±0.301 0.89

表2 各組保存液中ALT、LDH的含量比較(U/L，)

表2 各組保存液中ALT、LDH的含量比較(U/L，)

注：與B組比較，*P＜0.05

組別 n ALT LDH A組20 10.6±5.01 150.1±70.4020 23.5±6.11 242.4±75.20 B組 20 24.1±5.24 239.8±71.91 C組 20 11.5±4.98* 148.3±69.70*D組

本實驗C組肝細胞的ALT及LDH含量顯著較B組低，ATP及EC值顯著較B組較高，均具有顯著差異(P＜0.05)；提示用TET-HCA液低溫灌洗并保存鼠肝2h，在減少肝細胞的能量消耗，保持供肝細胞的活性，減輕肝細胞損害方面具有比HCA液更好的效果，表明在低溫灌洗保存條件下保存大鼠供肝時，TET對HCA液具有積極的優(yōu)化作用。其原因可能與TET具有鈣離子拮抗及氧自由基清除雙重作用，彌補了HCA液不含鈣拮抗劑的不足，兩者產(chǎn)生了互補和(或)協(xié)同作用。

在冷保存期間影響器官活力的主要因素為灌注損傷、溶酶體酶釋放、線粒體功能障礙、細胞水腫及氧自由基形成等［5］。本實驗用TET-HCA液低溫灌洗并保存鼠肝2 h，對供肝的保護作用具有與UW液類似的較好效果。推測可能與下列因素有關［6-9］：①TET能穩(wěn)定細胞內Ca2+濃度，保護細胞膜通透性，可明顯抑制LDH的釋放和保護高能磷酸化合物，使肝細胞損害減輕，提高肝細胞活性；②能降低炎癥反應減輕組織水腫，可能與其降低炎癥組織細胞內的Ca2+水平有關，因為在炎癥反應時，內皮細胞內的Ca2+升高可引起內皮細胞收縮，引起毛細血管通透性增加；③TET可減少自由基的產(chǎn)生和糾正超氧化物歧化酶(SOD)的生成不足。自由基是生物體內代謝過程中產(chǎn)生的具有強氧化活性的物質，自由基的大量產(chǎn)生，超過抗氧化系統(tǒng)的承受能力，可引起細胞脂質過氧化、蛋白質變性、DNA分解等病理變化［10］。同樣，亦有文章提出［11-12］，在移植腎缺血再灌注損傷的病理生理過程中，活性氧對腎組織的損傷作用是腎組織病變機制之一，甚至是許多因素損傷腎組織的最終遞質。總之，實驗結果的差異和機制值得進一步探討。

［1］Scotte M，Eschwege P，Cherruau C，et al.Liver preservation below 0 degrees C with UW solution and 2，3-butanediol［J］.Cryobiology，1996，33(1)：54-61.

［2］陳保華，黃 榮，車河龍，等.漢防已甲素不同給藥方式對大鼠供肝能量代謝的影響［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2011，11(8)：717-718.

［3］陳保華，黃 榮，姚 斌，等.漢防已甲素對低溫灌洗保存大鼠供肝的肝臟功能影響的實驗研究［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2011，11(9)：814-816.

［4］趙建生，佟波濤，段加方，等.肝移植術中心跳驟停4例臨床初探［J］.東南國防醫(yī)藥，2009，11(4)：326-328.

［5］Jamieson NV，Sundberg R，Landell S，et al.Preservation of the canine liver for 24-28 hours using simple cold storage with UW solutin［J］.Transplantation，1988，46(6)：517-519.

［6］Chen XH，Hu YM，Liao YQ.Protective effect of tetrandrine on CCl4atocytes［J］.Acta Pharmacologica Sinica，1996，17(6)：348-350.

［7］劉玉蘭，李定國，陸漢明.漢防己甲素對肝細胞生長增殖的影響［J］.上海第二醫(yī)科大學學報，1995，15(3)：212-215.

［8］范列英，孔憲濤.漢防己甲素對成纖維細胞及膠原合成的影［J］.臨床肝膽雜志，1995，11(8)：25-26.

［9］陽文新，鐘正江，申 紅，等.肝移植術后早期并發(fā)癥的診治(附44 例報告)［J］.東南國防醫(yī)藥，2005，7(3)：169-207.

［10］王春戰(zhàn).姜黃素抗類抗氧化作用的研究進展［J］.醫(yī)學研究生學報，2012，25(6)：658-660.

［11］Maiese K，Boniece I，DeMeo D，et al.Peptide grewth factors protect against ischemia in culture by prewvnting nitricoxide toxicity［J］.Meurosci，1993，13(7)：3034-3040.

［12］丁國永，郭 麗，杜忠君，等.骨髓間充質干細胞對腎缺血再灌注損傷后腎功能及氧化應激水平的改善作用［J］.吉林大學學報：醫(yī)學版，2009，35(4)：587-590.