徐艷麗，李青菊

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 450014）

近年來他汀類藥物對糖尿病腎病非依賴降脂的腎臟保護作用越來越受到人們的重視。糖尿病腎病早期病理特征為腎小球系膜細胞的增殖與肥大［1］。p27是一種重要的細胞周期激酶抑制劑，其在腎小球系膜細胞增殖與肥大過程中起到重要作用［2］。他汀類藥物是否通過影響p27蛋白的表達來發(fā)揮非依賴降脂的腎臟保護作用目前還不完全清楚。本實驗采用體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，觀察辛伐他汀及阿托伐他汀對高糖刺激大鼠腎小球系膜細胞p27蛋白表達的影響，以探討他汀類藥物的非依賴降脂腎臟保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎小球系膜細胞株（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會，細胞數(shù)量5×107），葡萄糖濃度為5.6mmol／L的低糖DMEM（細胞培養(yǎng)基）培養(yǎng)液（Thermo公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司），辛伐他?。∕erck公司），阿托伐他汀（輝瑞制藥有限公司），兔抗p27單克隆抗體（CST公司），鼠抗β－actin單克隆抗體（武漢博士德公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將大鼠腎小球系膜細胞置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)，每2天換液1次，待細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶底的80%時可行傳代培養(yǎng)。傳至第5～6代可進行實驗。實驗前24h用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。細胞分為4組（各組細胞數(shù)量106）：正常對照組：培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為5.6mmol／L；高糖組：葡萄糖濃度為30mmol／L；高糖辛伐他汀組：葡萄糖濃度為30mmol／L，辛伐他汀濃度為10μmol／L；高糖阿托伐他汀組：葡萄糖濃度為30mmol／L，阿托伐他汀濃度為10μmol／L。每組設(shè)置6個復(fù)孔，于24、48、72、120h收集細胞進行蛋白及mRNA的測定。

1.2.2 觀察細胞形態(tài) 4組細胞分別在24、48、72、120h在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）測定細胞p27mRNA的表達采用Trizol試劑提取細胞總mRNA，RT－PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。RT－PCR法測定大鼠腎小球系膜細胞p27mRNA的表達，RT－PCR引物詳細序列如下：p27引物序列：正鏈為5′－GGA CTT GGA GAA GCA CTG C－3′，反鏈為5′－CGA GTC AGG CAT TTG GTC C－3′，擴增片段大小為282bp。GAPDH引物序列：正鏈為5′－GAC AAG ATG GTG AAG GTC GG－3′，反鏈為5′－CAT GGA CTG TGG TCA TGA GC－3′，擴增片段大小為538bp。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸30s，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min，循環(huán)38次。PCR產(chǎn)物加于2%的瓊脂糖凝膠（0.5μg／mL EB），120V電泳20min。通過凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，測定電泳條帶的灰度，灰度值是將目的基因與內(nèi)參基因的電泳條帶灰度值相比作為數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4 Western blotting測定細胞p27蛋白的表達 裂解液裂解細胞收集細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白濃度的測定，取總蛋白75μg，經(jīng)12%的SDS－PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，并用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果。然后用含有封閉液的TBST室溫封閉1h，棄去原有封閉液，加入用5%脫脂奶粉稀釋的p27兔單克隆抗體（1∶1000稀釋）及β－actin單克隆抗體（1∶500稀釋），4℃過夜。洗膜后加辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG（1∶4000稀釋），置于脫色搖床上，使之充分反應(yīng)2h。再次用TBST洗膜3次，每次15min，再次洗膜后加入ECL顯色劑，增強化學(xué)發(fā)光。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)及Genetool軟件對蛋白條帶進行分析，用測量得到的p27／β－actin光密度比值作為p27蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎小球系膜細胞形態(tài)學(xué) 正常對照組腎小球系膜細胞呈長梭形，核呈圓形，居中間。高糖組細胞數(shù)量增多，體積增大，成旋渦狀排列。高糖辛伐他汀組和高糖阿托伐他汀組細胞數(shù)量減少。見圖1。

2.2 各組大鼠腎小球系膜細胞p27mRNA轉(zhuǎn)錄水平 表1結(jié)果顯示，在不同時間段，高糖組、高糖辛伐他汀、高糖阿托伐他汀組p27mRNA轉(zhuǎn)錄量均較正常對照組升高（P＜0.05）；在不同時間段，高糖辛伐他汀組、高糖阿托伐他汀組大鼠腎小球系膜細胞p27mRNA表達較高糖組降低（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠腎小球系膜細胞p27蛋白表達水平 表2結(jié)果顯示，在不同時間段，高糖組、高糖辛伐他汀組、高糖阿托伐他汀組p27蛋白表達均較正常對照組升高（P＜0.05）；在48、72及120h，高糖辛伐他汀組p27蛋白表達均較高糖組降低（P＜0.05）；在24、48、72及120h，高糖阿托伐他汀組p27蛋白表達均較高糖組降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠腎小球系膜細胞形態(tài)學(xué)

表1 各組大鼠腎小球系膜細胞p27mRNA轉(zhuǎn)錄水平（，n＝6）

表1 各組大鼠腎小球系膜細胞p27mRNA轉(zhuǎn)錄水平（，n＝6）

a：P＜0.05，與正常對照組比較；b：P＜0.05，與高糖組比較。

組別24h 48h 72h 120h正常對照組 0.384±0.175 0.386±0.210 0.392±0.172 0.395±0.182高糖組 1.006±0.182a 1.010±0.210a 1.384±0.175a 1.639±0.279a高糖辛伐他汀組 0.887±0.172a 0.697±0.249ab 0.656±0.096ab 0.560±0.144ab高糖阿托伐他汀組 0.866±0.085ab 0.688±0.256ab 0.630±0.166ab 0.537±0.141ab

表2 各組大鼠腎小球系膜細胞p27蛋白相對表達量（，n＝6）

表2 各組大鼠腎小球系膜細胞p27蛋白相對表達量（，n＝6）

a：P＜0.05，與正常對照組比較；b：P＜0.05，與高糖組比較。

組別24h 48h 72h 120h正常對照組0.72±0.11 0.78±0.13 0.98±0.21 1.30±0.27高糖組 1.21±0.10a 1.45±0.18a 1.79±0.20a 2.09±0.13a高糖辛伐他汀組 1.08±0.05a 1.25±0.14ab 1.45±0.15ab 1.49±0.21b高糖阿托伐他汀組 0.86±0.14ab 1.27±0.11ab 1.31±0.16ab 1.52±0.20b

3 討 論

有文獻報道，高糖培養(yǎng)下腎小球系膜細胞前期以增殖為主，進一步的高糖刺激，細胞復(fù)制停滯于G1期，引起細胞的肥大［3－6］。在高糖狀態(tài)下，p27蛋白的過度表達，抑制了細胞周期素激酶的活性，激酶活性的降低導(dǎo)致了腎小球系膜細胞停滯于G1期，不能正常進入S期，出現(xiàn)肥大。國外研究報道，體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞在高糖刺激下也停頓于細胞周期的G1期，且發(fā)生了細胞的肥大［7］，并且p27蛋白水平也呈增高趨勢。與本研究結(jié)果較為一致。

近年來他汀類藥物的非依賴降脂的腎臟保護作用越來越受到人們的重視。糖尿病腎病的重要病理特征之一便是轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF－β1）的過度表達，辛伐他汀可明顯降低高糖培養(yǎng)下腎小球系膜細胞上清液中TGF－β1的濃度的，并抑制腎小球系膜細胞的增殖及減少細胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，從而發(fā)揮腎臟保護作用［8］。也有研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可通過降低糖尿病腎病患者血清相關(guān)炎癥因子如CRP、IL－6及TNF－α的水平進而減少尿蛋白，保護腎臟功能［3，9］。阿托伐他汀可通過降低糖尿病腎病患者超敏C反應(yīng)蛋白、蛋白尿延緩腎功能的惡化［4，10］。阿托伐他汀也可抑制腎小球系膜細胞的增殖、抑制血管緊張素Ⅱ、TGF－β1的表達及分泌，進而降低基質(zhì)蛋白的生成與沉積發(fā)揮保護腎臟的功能［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀與阿托伐他汀可明顯降低高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞p27蛋白表達水平及mRNA轉(zhuǎn)錄水平，據(jù)此可以認(rèn)為，辛伐他汀與阿托伐他汀可通過抑制p27蛋白的表達，使細胞周期能夠順利地進入S期，降低腎小球系膜細胞的肥大，減輕糖尿病腎病患者的腎臟肥大，對腎臟發(fā)揮保護作用。因此本研究建議，無論糖尿病患者有無脂質(zhì)代謝異常，均可以使用他汀類藥物治療早期糖尿病腎?。?2］。

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