路則寶，白現(xiàn)廣

（1.楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，云南楚雄 675005；2.平頂山學(xué)院，河南平頂山 467099）

分子生物學(xué)技術(shù)是21世紀主導(dǎo)技術(shù)之一，它的發(fā)展大大拓寬和深化了微生物檢驗技術(shù)的發(fā)展，使醫(yī)學(xué)工作者能從DNA、RNA水平上對病原微生物進行檢測.其中聚合酶鏈反應(yīng)（plolymerase chain reaction，PCR）作為體外核酸擴增技術(shù)在病原微生物的檢測和鑒定、病毒基因的快速診斷、腫瘤基因的篩查等方面廣泛應(yīng)用.核酸探針技術(shù)以其敏感、特異、快速等特點已應(yīng)用于病原菌的檢測.生物芯片（bio- chip）技術(shù)也以其特有的高通量、多信息量、可快速同時檢測多種待檢樣品的特點在病原菌的檢測方面具有獨特的優(yōu)勢[1].現(xiàn)對PCR、核酸探針和生物芯片等分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗中的最新應(yīng)用研究進展進行綜述，以期為相關(guān)的研究提供有價值的參考.

1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)在微生物檢驗中最有價值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對病原微生物的檢測.通過在同一反應(yīng)管中同時加上多種病原微生物的特異性引物進行擴增，可用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定出是哪種病原微生物感染[2].我國20世紀90 年代中期，PCR 技術(shù)已經(jīng)廣泛地用于檢測感染性病原微生物，如人類免疫缺陷病毒（HIV），肝炎病毒（HBV）、HCV、性病致病菌等病原菌的檢驗[3]，現(xiàn)在PCR 技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于檢測鑒定分枝桿菌和檢測結(jié)核桿菌耐藥基因[4]，近幾年來令全球恐慌的禽流感的致病病毒的檢測也采用了PCR手段[5].

PCR技術(shù)具有快速、靈敏、準確的優(yōu)點，只要樣本中有一個病原體存在，在理論上，通過PCR就可以檢測到.PCR技術(shù)不受混合標本的影響，可輕易從含有大量正常菌群的標本中鑒定病原菌[6]，而且對于一些不易分離培養(yǎng)，生長緩慢或不能人工培養(yǎng)，血清學(xué)方法不能明確或者檢測靈敏度底的病原菌，比如分支桿菌、幽門螺桿菌、支原體衣原體、螺旋體、大多數(shù)病毒等，應(yīng)用PCR技術(shù)則具有獨特的優(yōu)勢[7]，因此PCR技術(shù)在病原微生物檢測和鑒定方面有著廣闊的應(yīng)用前景.

當然常規(guī) PCR技術(shù)也存在很多的問題，如出現(xiàn)假陽性、形成引物二聚體、傳統(tǒng)的PCR技術(shù)一次擴增只能檢測一種微生物、RNA病毒的PCR檢測操作繁瑣，中間污染環(huán)節(jié)多，易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果等.為了彌補上面這些不足，一些新的PCR技術(shù)逐漸衍生出來并被用于實踐，如熱啟動PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、隨機引物DNA 多態(tài)性擴增（RAPD）、限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）、實時熒光PCR（real-time PCR）等[8].

綜上，PCR技術(shù)將來有可能完全改變微生物檢驗的發(fā)展，使微生物檢驗發(fā)展為分子水平上的確診，而不再局限于外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性等一般檢驗.

2 核酸探針技術(shù)

核酸探針是指帶有標記的特異DNA片段，根據(jù)堿基互補配對的原則，核酸探針能特異的與目的DNA雜交，最后再用特定的方法測定標記物.探針標記的方式分為放射性標記和非放射性標記，目前用的較多的是非放射性標記，主要有生物素標記、地高辛標記、免疫標記、熒光素標記等幾種，具有直觀、準確的特點[9].應(yīng)用較廣泛的生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)標記的探針已在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒檢測中得到應(yīng)用.

目前核酸探針在微生物檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用主要在以下幾個方面：用于檢測無法培養(yǎng)、不能進行生化鑒定、產(chǎn)生不可觀察的微生物產(chǎn)物以及缺乏診斷抗原等病原體的檢測；用于檢測病毒病，如檢測肝炎病毒；用于流行病學(xué)調(diào)查研究，區(qū)分有毒和無毒菌株；檢測細菌內(nèi)抗藥基因；用于分析食品是否會被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性，比如Yasuhara[10]等以啤酒腐敗菌中厭氧菌Pectinatus的16S rRNA為靶分子設(shè)計寡核苷酸探針，并用熒光標記檢測啤酒是否被這種菌污染.

3 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是20 世紀90 年代中期以來影響深遠的科技進展之一，是融合了微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和計算機科學(xué)等為一體的高度交叉的尖端新技術(shù)[11].生物芯片根據(jù)反應(yīng)體系狀態(tài)的不同，可分為固相芯片和液相芯片，根據(jù)檢測對象的不同又可分為基因芯片和蛋白芯片.液相芯片較傳統(tǒng)的固相芯片相比主要優(yōu)點在于：檢測準確度高，信息質(zhì)量穩(wěn)定，檢測結(jié)果可重復(fù)性好，檢測用時短以及操作簡便.因此液相芯片在生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，比如病原菌感染的檢測方面，有著廣闊的應(yīng)用前景.現(xiàn)在液相芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因檢測、細胞因子檢測、蛋白質(zhì)分析和藥物檢測等，極大的推動了臨床檢測和科學(xué)研究的快速發(fā)展[12].

基因芯片因其可快速、準確、高效的地顯示病原體的遺傳信息，已廣泛的應(yīng)用于基因序列的分析、病原微生物感染的快速診斷、病原菌變異及耐藥機制的研究，以及基因分型、分子流行病學(xué)調(diào)查和抗感染藥物的研制等[13].基因芯片技術(shù)的興起也給微生物檢測帶來了新的革命，近年來已有此技術(shù)應(yīng)用于大腸埃希菌、痢疾志賀菌、傷寒沙門菌檢測的報道[14]，應(yīng)用基因芯片技術(shù)還可鑒定分枝桿菌菌種和檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因[15].隨著基因芯片技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，以及眾多的微生物全基因序列的測定，在將來人們或許可以在一張芯片上檢測出幾乎所有的病原菌.

綜上，生物芯片技術(shù)與傳統(tǒng)微生物檢測方法相比，樣品需求量少，檢測效率高，因此在微生物檢驗領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景.

4 其它分子生物技術(shù)在微生物檢驗中的應(yīng)用

在食品微生物檢驗中，ATP生物發(fā)光法可用于生乳中細菌的快速檢測[16]，這種方法具有準確、便利、快速的優(yōu)點，能夠在 5～10 min內(nèi)檢測出牛奶中細菌的數(shù)量.

快速檢測病原菌的自動分析系統(tǒng)也越來越多，比如Dupont de Nemours公司生產(chǎn)的Ribo PrinterTMDNA指紋圖譜自動分析系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)得到的核酸圖譜與其他貯存的核酸堿基序列進行比較，通過核酸匹配分析可以對微生物進行鑒定.

另外，氣相色譜和高效液相色譜的分析也應(yīng)用到致病微生物的檢測中，主要是依據(jù)不同病原體的化學(xué)組成或所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各異，利用上述色譜檢查可直接分析各種體液中的細菌代謝產(chǎn)物、細胞中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學(xué)標志成分，協(xié)助病原診斷和檢測，其中以氣相色譜應(yīng)用較多，該法簡單、快速[17].

5 分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗應(yīng)用中的發(fā)展趨勢

分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗應(yīng)用中的發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下三個方面：一是朝著高度特異性、高度靈敏性和高度自動化的方向發(fā)展；二是會進一步與其它學(xué)科技術(shù)交叉融合，打破各技術(shù)之間的局限，從而將檢驗的范圍擴展；三是新的分子生物學(xué)技術(shù)還將會不斷的產(chǎn)生，其在微生物檢驗中的應(yīng)用也將越加廣泛.

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