龍民慧，朱澤軼，王園園，武立昌，白喜龍，刁愛坡*，王嘉璽，鄒民吉，徐東剛*

(1．華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631;2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100850;3．天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

高血壓是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要風(fēng)險(xiǎn)因素之一，大多數(shù)與高血壓相關(guān)的心血管病是動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥．因此，高血壓動(dòng)脈粥樣硬化防治的研究是熱點(diǎn)問題．SRH系是軍事醫(yī)科院研制的一種重組多功能融合蛋白［1］，與現(xiàn)有的葡激酶相比，除了有溶栓作用、抗凝等特點(diǎn)．炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用．已有研究證實(shí)SRH能夠通過減弱炎癥從而干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展并且具備安全性高等特點(diǎn)［2-3］，是良好的抗動(dòng)脈硬化藥物，但是對(duì)其是否抑制高血壓癥并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制研究尚未開展．

SHR大鼠(Spontaneously hypertensive rat，SHR)能自發(fā)形成高血壓，血管易發(fā)生損傷，自發(fā)改變血液狀態(tài)和引起血管重構(gòu)，形成斑塊，最后導(dǎo)致血管狹窄和斑塊不穩(wěn)，血栓形成．該大鼠模型除了用于抗高血壓藥物研發(fā)，也經(jīng)常用于研究抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的動(dòng)物模型，研究表明在飲食中添加脂類物質(zhì)就能迅速提高SHR血脂水平，容易引起脂肪沉著，形成斑塊．目前，用SHR模型評(píng)價(jià)抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物研究集中在干預(yù)血管重構(gòu)、改變血液粘稠度和凝血指標(biāo)變化以及炎癥指標(biāo)變化上，有部分研究也開始觀察SHR的血脂變化和動(dòng)脈粥樣斑塊關(guān)系．本文旨在通過高血壓大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察葡激酶突變體SRH對(duì)自發(fā)性高血壓癥大鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的保護(hù)作用，為探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化提供依據(jù)．

1 材料和方法

1．1 材料

重組SRH蛋白由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基因組工程研究室所提供;血液生化指標(biāo)檢測(cè)所用儀器及相關(guān)試劑由北京中同藍(lán)博臨床檢驗(yàn)所提供;卵清白蛋白干粉和牛血清白蛋白干粉購自Sigma公司;牛脫氧膽酸鈉、膽固醇干粉購自北京普博欣生物科技有限公司;蛋黃粉、豬大油和白糖由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;丙基硫氧嘧啶購自北京紅惠生物制藥股份有限公司．

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 大鼠模型篩選和動(dòng)脈粥樣硬化模型建立正常大鼠WKY(Wistar Kyoto)大鼠20只，購自北京維通利華，動(dòng)物編號(hào)為:SCXK(京)2006-0009，入選標(biāo)準(zhǔn)為:①180～200 g;②9周齡雄性大鼠;③試驗(yàn)前經(jīng)全面觀察無異常表現(xiàn)．在恒溫(20℃ ±2℃)恒濕(50% ±5%)條件下飼養(yǎng)，自由飲水，每天人工照明12 h，正常飼料喂養(yǎng)5周，作為正常對(duì)照．20只雄性SHR大鼠，購自北京維通利華，動(dòng)物編號(hào)為:SCXK(京)2006-0009，入選標(biāo)準(zhǔn)同WKY大鼠入選標(biāo)準(zhǔn)，用于建立大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化模型．SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予高脂飼料(20%豬大油、5%白糖、3%膽固醇、0．5%膽酸鈉、0．2%丙基硫氧嘧啶、1%的蛋氨酸、1%維生素D，2%蛋黃粉，68%的基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)4周并在高脂飼料開始喂養(yǎng)時(shí)進(jìn)行免疫刺激，通過尾靜脈注射牛血清白蛋白，濃度按照32 mg/kg體重，頻次為每周3次，共3周;在牛血清白蛋白刺激的過程中同時(shí)用卵清白蛋白進(jìn)行腹腔免疫，2．5 mg/kg，每3日1次，共3次．高脂飼料喂養(yǎng)1周后給大鼠一次性灌注維生素D3(25萬U/kg)．在恒溫(20℃ ±2℃)恒濕(50% ±5%)條件下飼養(yǎng)，自由飲水，每天人工照明12 h，高脂飼料喂養(yǎng)4周．

1．2．2 試驗(yàn)分組及給藥方法 飼養(yǎng)5周后，20只WKY大鼠體重為205～221 g，平均為 (209±6．18)g;20只SHR大鼠體重225～247 g，平均體重為 (236±6．94)g．2種大鼠分別隨機(jī)分為生理鹽水組和SRH組，每組10只，生理鹽水組大鼠注射0．4 mL生理鹽水;SRH組大鼠按0．5 mg/kg體重給藥．SRH經(jīng)生理鹽水稀釋后2 min內(nèi)完成尾靜脈注射，每2天1次，共10次．

1．2．3 觀察指標(biāo)

(1)臨床表現(xiàn) 觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出血情況，觀察部位有牙齦、腳趾、嘴、眼、耳、鼻、肛門、陰莖等尤其是注射部位及皮膚粘膜、內(nèi)臟和顱內(nèi)等，并監(jiān)測(cè)活動(dòng)、飲食和外觀等生命體征．

(2)生理生化指標(biāo)檢測(cè) 在給藥前和最后1次給藥后24 h后，通過靜脈采血采取所有大鼠血液，血液與枸椽酸鈉(0．13 mol/L)按9∶1 抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離血漿．并監(jiān)測(cè)心電、血壓生理指標(biāo)．Beckman CXⅣ全自動(dòng)生化分析儀分析生化指標(biāo)，包括部分凝血酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FG)、纖溶酶原(PLG)、D二聚體(D-D)、總甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、C反應(yīng)蛋白(CRP)，其操作按照相關(guān)的說明書進(jìn)行．

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)均表達(dá)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差．各組數(shù)據(jù)之間顯著性檢驗(yàn)用多個(gè)樣本均數(shù)比較及兩兩比較的ANOVA方差分析檢驗(yàn)．

2 結(jié)果與分析

2．1 SRH對(duì)大鼠血脂水平的影響

生理鹽水組大鼠和SRH組大鼠均無出血現(xiàn)象．注射SRH和生理鹽水大鼠活動(dòng)、飲食正常．注射SRH與注射生理鹽水的WKY大鼠的TG、TC、LDL、HDL無顯著性差異(P＞0．05);但注射SRH與注射生理鹽水的 SHR大鼠有顯著性差異(P＜0．05)，SRH能降低高脂喂養(yǎng)SHR大鼠的血脂水平(表1)．

2．2 SRH對(duì)大鼠凝血系統(tǒng)的影響

注射SRH與注射生理鹽水的WKY大鼠的FG、APTT、TT、PT 無顯著性差異(P ＞0．05);但注射SRH與注射生理鹽水的SHR大鼠的FG、TT、PT有顯著性差異，SRH能夠降低高脂喂養(yǎng)大鼠的FG水平(P＜0．05)，延長高脂喂養(yǎng)大鼠的 TT、PT(P ＜0．05)，對(duì) APTT無任何影響(表2)．

2．3 SRH對(duì)大鼠纖溶系統(tǒng)的影響

纖溶指標(biāo)PIG、PAI、D-D在WKY大鼠及高血脂的SHR大鼠中，生理鹽水組和SRH組均無顯著性差異(P＞0．05)(表3)，表明SRH對(duì)纖溶系統(tǒng)無影響．

2．4 SRH對(duì)大鼠血清心肌酶譜變化的影響

注射SRH與注射生理鹽水的WKY大鼠的CK、CK-MB、ASL、LDH 無顯著性差異(P ＞ 0．05)(表4);但注射SRH與注射生理鹽水的SHR大鼠的CK-MB、ASL、LDH 有顯著性差異(P ＜ 0．05)，SRH能夠減弱SHR大鼠心血管系統(tǒng)損傷．

2．5 SRH對(duì)大鼠血壓和心率變化的影響

注射SRH與注射生理鹽水的WKY大鼠在處理前后的血壓和心率無顯著性差異(P＞0．05)(表5);注射生理鹽水的高血脂SHR大鼠在處理前后血壓和心率有顯著性差異(P＜0．05)，有明顯的升高趨勢(shì)，但注射SRH的高血脂SHR大鼠在處理前后血壓和心率沒有顯著差異(P＞0．05)，比較注射生理鹽水和SRH后的高血脂SHR大鼠的血壓和心率有顯著下降(P＜0．05)，表明SRH能有效降低高血脂SRH大鼠的血脂水平．

表1 SRH對(duì)大鼠血脂水平的影響Table 1 Effect of SRH on blood fat in rats

表2 SRH對(duì)大鼠凝血指標(biāo)的影響Table 2 Effect of SRH on blood coagulation in SHR rats

表3 SRH對(duì)大鼠纖溶系統(tǒng)的影響Table 3 Effect of SRH on blood fibrinolysis in SHR rats

表4 SRH對(duì)大鼠血清損傷的影響Table 4 Effect of SRH on blood damage in SHR rat

表5 SRH對(duì)大鼠心率和血壓的影響Table 5 Effect of SRH on BP and BR in WKY rat

3 討論

SHR大鼠易發(fā)生高血壓癥，高血壓容易造成血栓或動(dòng)脈斑塊形成［4］．本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)14周齡SHR大鼠5周，SHR大鼠血漿TC、LDL水平升高，而與注射生理鹽水的高血脂SHR大鼠相比，注射SRH的SHR大鼠血漿中的TG、TC、LHL的水平有明顯降低(P＜0．05)．本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):SRH能夠明顯改善SHR血液的高凝狀態(tài)，高脂給藥組FG明顯低于高脂生理鹽水組，PT、TT能得到明顯延長(P＜0．05);而高脂給藥組與WKY給藥組相比各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯差異．本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn):PIG、PAI和D-dimer未見明顯變化，說明SRH對(duì)纖溶系統(tǒng)的功能不會(huì)造成影響，提示SRH溶栓后不會(huì)引起持續(xù)的系統(tǒng)纖溶亢進(jìn)狀態(tài)．

當(dāng)血管堵塞時(shí)，心肌細(xì)胞容易缺血缺氧或壞死，多種心肌酶可進(jìn)入血液循環(huán)，引起血清心肌酶學(xué)升高［5］．鑒于各種心肌酶在機(jī)體組織中分布的非特異性，本實(shí)驗(yàn)采用多項(xiàng)酶的聯(lián)合檢測(cè)來提高檢測(cè)的敏感性和特異性．結(jié)果發(fā)現(xiàn):SRH處理的SHR大鼠組的AST、CK-MB、LDH水平明顯低于生理鹽水處理的SHR大鼠(P＜0．05);說明SRH能夠降低高脂飼料喂養(yǎng)的SHR心肌酶學(xué)水平，減少循環(huán)系統(tǒng)的損傷程度．

心肌自主節(jié)律功能通過血壓、心率的變化來體現(xiàn)［6］．本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)SRH能夠降低SHR血壓水平，降低SHR大鼠的心率(P＜0．05)．這可能由于SRH減少SHR體內(nèi)炎癥反應(yīng)，降低血液粘稠度和血管病變程度，從而降低了血壓，減少心臟負(fù)擔(dān)，使心律接近正常水平．

對(duì)正常喂養(yǎng)的WKY大鼠注射SRH，其血脂水平和生理鹽水組相比無顯著變化，可見使用SRH對(duì)正常大鼠脂肪代謝無顯著影響．正常大鼠注射SRH后FG、PT、APTT、TT無顯著差異，表明SRH對(duì)正常大鼠的內(nèi)外源性凝血功能未造成顯著影響，因而是相對(duì)安全的．血漿中PIG、PAI和D-dimer是反映纖溶狀態(tài)的良好指標(biāo)，系統(tǒng)纖溶亢進(jìn)時(shí)顯著增加［7-8］．本研究各組動(dòng)物使用SRH這種溶栓劑溶栓后PIG、PAI均未出現(xiàn)下降，且D-dimer均無顯著變化，提示SRH未引起持續(xù)的系統(tǒng)纖溶亢進(jìn)狀態(tài)．正常大鼠在使用SRH后其血壓和心率也未受影響，說明SRH未改變心血管功能．

本研究證實(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間SRH是相對(duì)安全的，它能夠改善高血壓大鼠的血液高凝狀態(tài)和高血壓狀態(tài)，降低血脂水平，并且高血壓狀態(tài)下心率過快得以緩解，以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步臨床的研究提供了一定的依據(jù)．

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