EZH2和P57在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

劉 飛，肖瑞海，洪正東，魯雄兵，史子敏，習(xí)小慶，潘正躍

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006）

腎細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱腎癌）是最常見的腎臟惡性實(shí)體腫瘤，約占成人惡性腎腫瘤的90%以上，其中75%～80%為透明細(xì)胞癌[1-2]。目前，我國(guó)腎癌發(fā)病率占成人全身腫瘤的2%～3%，每年腎癌新發(fā)病人數(shù)在2.0萬(wàn)～4.7萬(wàn)，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[3]。腎癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多階段及多步驟改變的過(guò)程，癌基因激活或（和）抑癌基因失活致瘤作用尤為重要。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)EZH2和P57在腎癌的表達(dá)，探討其與腎癌臨床病理特征間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2004—2005年腎腫瘤初次手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為腎癌的手術(shù)存檔標(biāo)本64例，男38例，女26例，平均年齡58.3歲。所有患者術(shù)前均未接受任何治療。按1997年WHO組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：高分化（FuhrmanⅠ級(jí)+Ⅱ級(jí)）14例，中分化（Fuhrman Ⅲ級(jí)）23 例，低分化（FuhrmanⅣ級(jí)）27例。按AJCC-TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：局限性腎癌（T1+T2）36 例，局部進(jìn)展性腎癌（T3）28 例。 術(shù)后伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者44例。另取腎癌手術(shù)后距腫瘤邊緣3 cm以外的正常腎組織和腎外傷后切除的正常腎組織12例作為對(duì)照。

1.2 主要試劑

兔抗人EZH2多克隆抗體、兔抗人P57多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，二步法免疫組織化化檢測(cè)試劑（PV-6000-G）購(gòu)自美國(guó)GBI公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

采用免疫組織化學(xué)二步染色法檢測(cè)腎癌和正常腎組織標(biāo)本中EZH2和P57蛋白的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。用磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照。采用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)，隨機(jī)計(jì)算5個(gè)高倍鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的百分比，陽(yáng)性細(xì)胞比值0%～25%為蛋白陰性表達(dá)，＞25%為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EZH2在正常腎和腎癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果示：正常腎組織和腎癌組織的EZH2陽(yáng)性表達(dá)染色主要集中在細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀。正常腎組織EZH2陽(yáng)性表達(dá)率為16.67%，腎癌組織EZH2陽(yáng)性表達(dá)率為78.13%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。EZH2陽(yáng)性表達(dá)率隨腎癌臨床分期和病理分級(jí)升高而增加，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組EZH2陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，但與患者性別和年齡無(wú)關(guān)，見表1。

表1 EZH2和P57表達(dá)與腎癌臨床病理特征的關(guān)系 例

2.2 P57在正常腎組織和腎癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果示：正常腎組織和腎癌組織中P57陽(yáng)性表達(dá)染色主要集中在細(xì)胞漿和部分胞膜，呈棕黃色顆粒狀；正常腎組織中P57陽(yáng)性表達(dá)率為75.00%，腎癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為26.56%，正常腎組織中P57陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腎癌組織（P＜0.01）。P57陽(yáng)性表達(dá)率隨腎癌臨床分期和病理分級(jí)升高而呈下降趨勢(shì)，且淋巴轉(zhuǎn)移組P57表達(dá)水平低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，但與患者性別和年齡無(wú)關(guān)，見表1。

2.3 EZH2與P57在腎癌中表達(dá)的相關(guān)性

EZH2和P57在腎癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.13%和26.56%，相關(guān)性分析顯示，P57和EZH2在腎癌組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.648，P＜0.05）。

3 討論

腎癌是最常見的腎臟惡性實(shí)體腫瘤。在腎癌患者中，約30%為晚期腫瘤，約30%局限性腎癌患者術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[4]。腎癌的主要治療方法為手術(shù)，轉(zhuǎn)移性和晚期腎癌的治療手段包括放療、化療、免疫治療和分子靶向治療。當(dāng)前研究[5]已證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和mTOR信號(hào)通路為腎癌分子靶向治療的有效靶點(diǎn)。2006年，靶向VEGF和mTOR信號(hào)通路的藥物逐步應(yīng)用于晚期和轉(zhuǎn)移性腎癌患者的臨床治療，顯示出較免疫治療更為確切的療效，靶向治療后患者總體生存期延長(zhǎng)至40個(gè)月，腫瘤無(wú)進(jìn)展生存期為27個(gè)月，但這些藥物仍然難以達(dá)到并保持長(zhǎng)期持久的完全治療效果。因此急需鑒定出能更好地反映腫瘤生物學(xué)行為的腎癌標(biāo)志物，并能為腎癌基因治療提供新的更有效的治療靶點(diǎn)。

EZH2是PRC2復(fù)合物的主要成員，EZH2作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，主要介導(dǎo)組蛋白H3-K27甲基化，直接調(diào)控DNA甲基化進(jìn)而沉默許多靶基因。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，EZH2在前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌及胃癌等多種腫瘤組織中表達(dá)異常。與相應(yīng)正常組織相比，EZH2表達(dá)水平在腫瘤組織中異常升高，且其表達(dá)水平越高提示腫瘤處于晚期以及預(yù)后不良。有研究顯示，EZH2表達(dá)水平能夠?yàn)榍傲邢侔┗颊叩念A(yù)后提供有價(jià)值的指導(dǎo)意義[7]。近來(lái)，包括14種被EZH2抑制的靶基因在內(nèi)的多數(shù)抑制標(biāo)志物被用于預(yù)測(cè)前列腺癌和乳腺癌患者結(jié)局的工具[8]。通過(guò)分析乳腺癌患者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，EZH2水平異常升高與乳腺癌侵襲力和腫瘤細(xì)胞增殖率增加密切相關(guān)[9]；研究結(jié)果同樣揭示，EZH2可作為乳腺癌患者預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，并指出EZH2高表達(dá)與侵襲性腫瘤存在顯著相關(guān)性[6]。

本研究在蛋白水平證實(shí)EZH2在腎癌中表達(dá)水平上調(diào)，在正常腎組織中EZH2極低表達(dá)，且伴隨腎癌臨床分期升高、腫瘤細(xì)胞分化程度降低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)EZH2表達(dá)率呈明顯上升趨勢(shì)。表明EZH2與腎癌發(fā)生和臨床進(jìn)展有關(guān)，提示EZH2高表達(dá)可能使腎癌細(xì)胞不斷惡性增殖，且在此過(guò)程中腫瘤細(xì)胞逐漸獲得侵襲轉(zhuǎn)移的惡性表型，最終導(dǎo)致腫瘤臨床進(jìn)展。

EZH2通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移目前尚不清楚。有研究[10]表明，P57在眾多人類腫瘤中低表達(dá)且參與細(xì)胞周期和增殖的調(diào)節(jié)。Yang等[11]研究并提出，P57是EZH2的直接靶點(diǎn)，并且在乳腺癌中因?yàn)楸碛^遺傳學(xué)機(jī)制的調(diào)控而被抑制表達(dá)。因此，本研究在腎癌組織中檢測(cè)P57的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P57在腎癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常腎組織，且其陽(yáng)性表達(dá)率隨腎癌臨床分期升高、腫瘤細(xì)胞分化程度降低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)呈明顯下降趨勢(shì)，且發(fā)現(xiàn)P57與EZH2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)在腎癌中P57可能是EZH2的下游靶基因，提示EZH2可能靶向抑制P57表達(dá)而促進(jìn)腎癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致腎癌臨床進(jìn)展，但其靶向抑制的具體機(jī)制尚需要深入研究。

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics，2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63（1）:11-30.

[2] Karumanchi S A,Merchan J,Sukhatme V P.Renal cancer:molecular mechanisms and newer therapeutic options[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2002,11（1）:37-42.

[3] 蕭景丹.腎癌新增患者每年逾2萬(wàn)[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師:醫(yī)學(xué)專業(yè),2008,10（9）:41.

[4] Escudier B，Goupil M G，Massard C，et al.Sequential therapy in renal cell carcinoma[J].Cancer，2009，115（10）：2321-2326.

[5] Escudier B，Eisen T，Stadler W M，et al.Sorafenib in advanced clear-cell renal-cell carcinoma[J].N Engl J Med,2007,356（2）:125-134.

[6] Fujii S，Ochiai A.Enhancer of zeste homolog 2 downregulates E-cadherin by mediating histone H3 methylation in gastric cancer cells[J].Cancer Sci，2008，99（4）：738-746.

[7] Varambally S，Dhanasekaran S M，Zhou M，et al.The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer[J].Nature,2002,419（6907）：624-629.

[8] Yu J，Yu J，Rhodes D R，et al.A polycomb repression signature in metastatic prostate cancer predicts cancer outcome[J].Cancer Res,2007,67（22）：10657-10663.

[9] Bachmann I M,Halvorsen O J,Collett K,et al.EZH2 expression is associated with high proliferation rate and aggressive tumor subgroups in cutaneous melanoma and cancers of the endometrium,prostate,and breast[J].J Clin Oncol,2006,24（2）:268-273.

[10] Hu T，Guo H，Wang W，et al.Loss of p57 expression and RhoA overexpression are associated with poor survival of patients with hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep,2013,30（4）：1707-1714.

[11] Yang X,Karuturi R K M,Sun F,et al.CDKN1C （p57） is a direct target of EZH2 and suppressed by multiple epigenetic mechanisms in breast cancer cells[J].PLoS One,2009,4（4）:e5011.