復(fù)合益生菌對高熱環(huán)境中仔豬生長性能、腸道菌群和熱休克蛋白表達的影響

蔣加進， 甘 芳， 胡志華， 陳興祥， 劉永杰， 黃克和

(1.金陵科技學(xué)院動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210038;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的不斷提高和全球逐漸變暖，高熱是影響豬只生長和健康的主要因素。中國夏季的時間普遍較長，江蘇省地處中國東部，長江、淮河下游，由于受溫帶向亞熱帶的過渡性氣候影響，加之近年來全球氣候變暖形勢日益嚴重，一般年份都會出現(xiàn)20～30 d的高溫天氣，梅雨期短的年份高溫日數(shù)可超過40 d［1］，豬只每年都要經(jīng)受長期的急性或慢性熱應(yīng)激，這嚴重制約了豬生產(chǎn)的效率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。近年來，許多研究者報道了高溫?zé)釕?yīng)激對豬采食量、免疫功能和血液中激素水平的影響［2-3］，但對于熱應(yīng)激的機理尚未完全闡明，防控也未能取得很好的效果。因此，尋找各種抗熱應(yīng)激的方法和在日糧中添加某些營養(yǎng)素成為目前養(yǎng)豬業(yè)研究的重點之一。

益生菌(Probiotic)起源于希臘文字，又名促生素、生菌劑、原生菌、微生態(tài)制劑、活菌制劑等，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)將其定義為“當(dāng)攝入一定量時能對宿主的健康有作用的活的微生物”［4］，主要包括乳酸菌類、雙歧桿菌類、芽孢桿菌類、光合細菌類和酵母類等。研究表明，益生菌能通過競爭性排斥病原、增強腸道屏障功能來防止腸道感染，維持腸道菌群平衡，提高免疫力，控制血清膽固醇，抗腫瘤等［5-7］。此外，益生菌能產(chǎn)生多種維生素，還能產(chǎn)生短鏈脂肪酸、抗氧化劑、氨基酸等，對機體的生長發(fā)育起著重要作用。近來有報道，益生菌具有緩解家禽熱應(yīng)激的能力［8］，但應(yīng)用益生菌尤其是應(yīng)用復(fù)合益生菌對豬熱應(yīng)激的影響鮮有報道。

熱休克蛋白(Hsps)屬于應(yīng)激蛋白家族，可出現(xiàn)于所有物種［9-11］。根據(jù)其分子量大小，可分為小Hsps、Hsp60、Hsp70和 Hsp90。熱應(yīng)激和其他應(yīng)激(如運輸、重金屬離子應(yīng)激)，可迅速誘導(dǎo)合成Hsp，保護細胞和機體免受應(yīng)激損傷［12］。近來有研究報道，熱應(yīng)激可增強雞Hsp70的表達［13］，益生菌(嗜酸乳桿菌)可降低熱應(yīng)激細胞中熱休克蛋白的表達［14］。但益生菌對高熱環(huán)境中豬Hsp mRNA水平的影響未見報道。

本試驗通過在飼料中添加不同劑量的復(fù)合益生菌，研究其對高熱環(huán)境中仔豬生長性能、腸道菌群和Hsp mRNA表達的影響，為研制豬熱應(yīng)激飼料添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)合益生菌制劑

試驗用復(fù)合益生菌制劑由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)代謝病研究室研制，1 ml含活菌數(shù)≥109個。復(fù)合益生菌主要成分為嗜酸乳桿菌和酵母菌等。

1.2 動物分組

選擇體重相近的45頭同批次35日齡三元雜交(杜×長×大)仔豬，隨機分成3組，每組3個重復(fù)，每重復(fù)5頭。

1.3 試驗飼糧配方及試驗處理

試驗基礎(chǔ)飼糧采用常規(guī)玉米豆粕型日糧，配方為:玉米 620.0 g/kg、豆粕 280.0 g/kg、乳清 50.0 g/kg、賴氨酸10.0 g/kg、甲硫氨酸 3.8 g/kg、色氨酸2.9 g/kg、蘇氨酸 8.4 g/kg、鹽 4.0 g/kg、磷酸氫鈣6.4 g/kg、碳酸鈣4.0 g/kg、預(yù)混料10.0 g/kg。其中1 kg預(yù)混料含維生素A 2 200 IU、維生素D 200 IU、維生素E 30 mg、維生素B14.4 mg、維生素B24 mg、維生素 B64 mg、維生素 B1215 μg、煙酸 22 mg、泛酸9 mg、生物素0.10 mg、葉酸0.35 mg以及微量元素Cu(CuSO4·5H2O)18 mg、Mn(MnSO4·H2O)55 mg、Fe(FeSO4·7H2O)80 mg、Zn(ZnSO4·7H2O)80 mg、I(KI)0.14 mg。在基礎(chǔ)飼糧中分別添加1%復(fù)合益生菌(試驗1組)、3%復(fù)合益生菌(試驗2組)飼喂仔豬，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧。

1.4 飼養(yǎng)管理與樣品制備

豬的飼養(yǎng)試驗于2012年夏天在江蘇蘇北某豬場進行。水泥料槽，乳頭式飲水器，每天喂料3次，自由采食和飲水，圈舍窗戶全部打開，自然通風(fēng)，每天記錄豬舍溫度，豬舍氣溫變動范圍為26～40℃。按豬場常規(guī)管理程序給試驗豬免疫和驅(qū)蟲。預(yù)試7 d，進入正試期后，各組分喂相應(yīng)日糧42 d。分別在35日齡(正式試驗之前)和77日齡(試驗結(jié)束)前腔靜脈采血，每頭豬各10 ml，EDTA抗凝。

1.5 生長性能的測定

試驗前和試驗結(jié)束時仔豬各稱體重1次，記錄體重和耗料量，計算各組的平均日增重、平均日采食量和料重比(耗料/增重)。

1.6 腹瀉率的測定

試驗開始后，每日觀察仔豬排糞情況，記錄腹瀉豬只數(shù)和持續(xù)時間，最后以每窩仔豬發(fā)生腹瀉的頭日數(shù)除以總的飼養(yǎng)頭日數(shù)計算出腹瀉率。

1.7 腸道菌群的測定

在35日齡及77日齡采取健康仔豬新鮮糞樣測定大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量。大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基，乳酸桿菌用乳酸桿菌培養(yǎng)基，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)。糞樣的采集、稀釋、培養(yǎng)和計數(shù)等參照文獻［15］方法進行，培養(yǎng)基制備參照文獻［16］方法進行。

1.8 Hsp70和Hsp27 mRNA水平測定

根據(jù)已發(fā)表的2個熱休克蛋白基因和1個內(nèi)參基因序列，用Primer primer(PREMIER Biosoft International，USA)設(shè)計引物，引物參數(shù)見表1?？俁NA的提取采用Trizol試劑盒(TaKaRa，China)按照說明書操作進行，采用 DNA-free kit試劑盒(TaKaRa，China)清除DNA污染，最后通過1.5% 瓊脂糖凝膠電泳和蛋白核酸測定儀檢測所提取的RNA質(zhì)量。Real-time PCR反應(yīng)體系與PCR擴增條件參照TaKaRa公司 PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒說明書。Real-time PCR擴增在7300 Real-time PCR System［美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)生產(chǎn)］上進行。所得試驗數(shù)據(jù)均以β-Actin為內(nèi)參基因，按△△Ct法進行比較分析，結(jié)果用2－△△Ct表示。

表1 熒光定量PCR的引物Table 1 Primers for fluorescent quantitative PCR

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計軟件17.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，試驗結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準差表示，并用LSD法檢驗分析各組間均數(shù)差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合益生菌對高熱環(huán)境下仔豬生長性能和腹瀉率的影響

試驗期間仔豬平均日增重、平均日采食量和料重比的測定結(jié)果見表2。與對照組相比，添加1%、3%復(fù)合益生菌試驗組平均日增重分別提高了3.49%、10.48%(P＜0.05)，料重比分別下降了3.46%、8.84%(P＜0.05)，腹瀉率分別下降了29.84%(P＜0.05)、51.29%(P＜0.05)。說明，日糧中添加復(fù)合益生菌制劑對高熱環(huán)境中斷奶仔豬的生長有良好的促進作用，可顯著降低腹瀉率。

表2 復(fù)合益生菌在高熱環(huán)境下對仔豬生長性能與腹瀉率的影響Table 2 Effect of multi-probiotics on the growth performance and diarrhea incidence of piglets under hyperthermic conditions

2.2 復(fù)合益生菌對高熱環(huán)境下仔豬腸道菌群水平的影響

各組35日齡和77日齡試驗豬腸道大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)結(jié)果見表3。飼喂飼料42 d后，1%和3%復(fù)合益生菌組77日齡豬糞便中的大腸桿菌數(shù)均顯著低于對照組(P＜0.05);而乳酸桿菌數(shù)均顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3 復(fù)合益生菌對高熱環(huán)境下仔豬 Hsp70和Hsp27 mRNA水平的影響

飼喂復(fù)合益生菌后仔豬血液中熱休克蛋白基因Hsp70和Hsp27 mRNA水平的變化見圖1、圖2。日糧中未添加復(fù)合益生菌前，各組血液中Hsp70和Hsp27 mRNA水平差異不顯著，說明正式試驗前各組基本處于同等水平。飼喂添加復(fù)合益生菌的飼料42 d后，3%復(fù)合益生菌組血液中熱休克蛋白基因Hsp70和Hsp27 mRNA水平顯著低于對照組(P＜0.05)，而1%復(fù)合益生菌組血液 Hsp70和 Hsp27 mRNA水平與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 飼喂不同日糧后仔豬血液中Hsp70 mRNA水平的比較Fig.1 The levels of Hsp70 mRNA in the blood of piglets fed on different diets

圖2 飼喂不同日糧后仔豬血液中Hsp27 mRNA水平的比較Fig.2 The levels of Hsp27 mRNA in the blood of piglets fed on different diets

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌對高熱環(huán)境下仔豬生長性能的影響

已有研究表明，在高溫環(huán)境下，豬的采食量和日增重降低，說明高溫會降低豬的采食量和日增重。據(jù)報道，硒和維生素E可清除熱應(yīng)激豬體內(nèi)的自由基，提高豬對高溫的耐受力［17］，也有報道稱益生菌能緩解家禽的熱應(yīng)激［18］。本試驗結(jié)果表明飼料中添加3%復(fù)合益生菌對緩解斷奶仔豬的熱應(yīng)激效果較好，能有效改善斷奶仔豬的生長性能，促進采食，提高日增重和飼料利用率，顯著降低腹瀉率。

3.2 復(fù)合益生菌對高熱環(huán)境下仔豬腸道菌群的影響

動物消化道內(nèi)存在著種類繁多的微生物，與自身的營養(yǎng)、生長、免疫抵抗病原菌入侵和消除某些化合物的毒性等都有密切關(guān)系［19］。腸道內(nèi)乳酸桿菌等有益菌的存在，可以分解碳水化合物，產(chǎn)生多種有機酸，它們的增殖不但能提高機體的消化機能，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且能競爭性地抑制某些入侵的病原菌或抑制腸道內(nèi)的有害菌的增殖，對畜禽的健康有益。本試驗使用的復(fù)合益生菌能顯著降低大腸桿菌等條件致病菌的數(shù)量，顯著增加乳酸桿菌等有益菌的數(shù)量，有助于恢復(fù)和保持正常胃腸道功能，增加胃腸蠕動，促進消化吸收，提高仔豬增重和降低料耗。

3.3 復(fù)合益生菌對高熱環(huán)境下仔豬Hsp mRNA水平的影響

熱應(yīng)激蛋白(Heat stress response protein)是指機體受到應(yīng)激原的刺激后產(chǎn)生的一組高度保守的蛋白質(zhì)，對維持細胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用，可以被高溫及各種使機體應(yīng)激的因素如射線、重金屬離子、細菌或病毒感染以及中毒、缺氧所誘導(dǎo)［20］。HSP70是此類蛋白中最保守、最重要的一種［21］。HSP70在應(yīng)激狀態(tài)下可在細胞內(nèi)迅速合成并轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)、核仁等區(qū)域，促進變性、損傷蛋白質(zhì)的恢復(fù)或清除，維持細胞的自身穩(wěn)定，可以提高機體的應(yīng)激耐受能力而起到保護機體的作用。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，飼料中添加3%復(fù)合益生菌可顯著降低高熱環(huán)境下斷奶仔豬血液中熱休克蛋白基因Hsp70和Hsp27 mRNA水平，表明在高熱條件下，復(fù)合益生菌有可能是通過調(diào)節(jié)Hsp70和Hsp27 mRNA的水平來緩解仔豬熱應(yīng)激的。因此，復(fù)合益生菌在夏天自然高熱應(yīng)激條件下可作為一種潛在的仔豬抗熱應(yīng)激添加劑。

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