胡 堅(jiān)，楊閏平，李恒進(jìn)，趙 華

解放軍總醫(yī)院 皮膚科，北京 100853

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，多被認(rèn)為由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，但近年來研究發(fā)現(xiàn)多種固有免疫細(xì)胞和成分也在銀屑病的發(fā)病中起到了重要作用。其中凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)是NLRP3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3)炎癥小體的組成部分。NLRP3炎癥小體作為一種固有免疫系統(tǒng)NOD樣受體(nucleotide binding oligomerization domain-，NOD)家族的胞內(nèi)模式識(shí)別受體，通過識(shí)別多種內(nèi)源性和外源性危險(xiǎn)信號(hào)，合成和釋放IL-1β和IL-18參與炎癥反應(yīng)并啟動(dòng)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)[1-2]。以往研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、2型糖尿病、克羅恩病等疾病的發(fā)生[3]，而銀屑病同樣作為一種非感染性炎癥性疾病，NLRP3炎癥小體是否參與其發(fā)病研究尚少。我們采用免疫組化方法對(duì)尋常型銀屑病皮損中ASC和caspase-1的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，并與正常人對(duì)照。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 2011年2月-2012年5月我科門診確診的尋常型銀屑病30例，其中首次發(fā)病5例，復(fù)發(fā)25例，均為進(jìn)展期，男18例，女12例，年齡23~54(40.45±9.58)歲，病程2個(gè)月~20年，銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)分為5.61~20.10(12.34±5.02)分，所有患者2個(gè)月內(nèi)無系統(tǒng)用藥，2周內(nèi)未使用銀屑病外用藥物。正常對(duì)照20例，年齡、性別與銀屑病患者匹配，為我科色痣患者切除時(shí)距離色痣邊緣3 mm以外的周邊正常組織。

2 免疫組化檢測(cè) 小鼠ASC、caspase-1多克隆抗體購自美國Abcam公司。常規(guī)方法制作標(biāo)本，2 μm厚度連續(xù)切片，Elivision免疫組化染色：高壓鍋加熱修復(fù)，雙氧水消除過氧化酶，分別滴加1∶100 ASC和1∶100 caspase-1一抗，4 ℃濕盒過夜后PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，室溫靜置20 min后PBS再洗3次，加三抗，操作步驟同前。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

3 結(jié)果判定 以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核棕黃色或棕褐色為陽性。由兩位醫(yī)生對(duì)免疫組化染色進(jìn)行評(píng)估。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野(×400)，計(jì)算平均每100個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞百分比，以及染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)分。根據(jù)陽性細(xì)胞比例，＜5%、5~25%、26%~50%、51%~75%和 ≥76%分別計(jì)為0~4分；并按染色強(qiáng)度無、弱、中、強(qiáng)分別計(jì)為0~3分。綜合兩個(gè)指標(biāo)將評(píng)分分為4級(jí)，0分為陰性、1~3分為弱陽性、4~5分為陽性、6~7分為強(qiáng)陽性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩獨(dú)立樣本正態(tài)分布定量資料，但組間方差不齊，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ASC兩組表皮中的表達(dá) 銀屑病患者皮損處表皮全層強(qiáng)陽性表達(dá)ASC，主要分布在胞漿、胞核，少數(shù)表達(dá)于胞膜，免疫組化綜合評(píng)分為4.48±0.36；正常人對(duì)照ASC主要表達(dá)于表皮中、下部，胞膜、胞漿、胞核均有表達(dá)，以輕、中度表達(dá)為主，免疫組化綜合評(píng)分為2.10±0.24。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=49，P＜0.01)，見圖1。

2 Caspase-1兩組表皮中的表達(dá) 在銀屑病患者皮損處caspase-1亦表達(dá)于表皮全層，位于胞漿，染色呈強(qiáng)陽性，免疫組化綜合評(píng)分為3.95±0.53；正常人對(duì)照caspase-1表達(dá)于基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層下部，染色強(qiáng)度較弱，免疫組化綜合評(píng)分為1.48±0.22。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=55，P＜0.01)，見圖2。

討 論

在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)被認(rèn)為具有重要作用。固有免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生和釋放一系列細(xì)胞因子、趨化因子、內(nèi)源性抗微生物物質(zhì)及激活固有免疫細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄因子來消除外來病原，并啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，其可能的作用途徑有：1)Toll樣受體(TLRs)：研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損處表皮上層角質(zhì)形成細(xì)胞高表達(dá)TLR1、TLR2，低表達(dá)TLR3、TLR4，此外使用TLR7激動(dòng)劑咪喹莫特可加重銀屑病皮損。TLR作為一種模式識(shí)別受體，通過MyD88/IRAK/TRAF6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活NF-κB，從而激活下游免疫反應(yīng)。2)抗菌肽(AMPs)：由角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞表達(dá)。AMPs除殺傷微生物外，AMPs的高表達(dá)可能通過募集炎癥細(xì)胞而促進(jìn)局部炎性反應(yīng)、血管生成、角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，從而形成銀屑病皮損。3)角質(zhì)形成細(xì)胞：作為一種前炎性細(xì)胞生產(chǎn)TNF-α、IL-1α、IL-6等細(xì)胞因子，繼而誘導(dǎo)IL-8等趨化因子的產(chǎn)生而趨化中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。4)NKT細(xì)胞：生成IFN-γ啟動(dòng)適應(yīng)性免疫，IFN-γ是導(dǎo)致銀屑病的重要介質(zhì)。5)DC細(xì)胞：表達(dá)自身肽/MHC復(fù)合物誘導(dǎo)T細(xì)胞的失能以及Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，從而打破免疫活性和免疫耐受的平衡，誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)，并可加強(qiáng)NKT細(xì)胞的活性。6)補(bǔ)體系統(tǒng)：C5a等誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，C5b-9也可能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[4-5]。

圖 1 a： SC表達(dá)于銀屑病皮損處表皮全層 ，呈強(qiáng)陽性 ，免疫組化(×200)； b： ASC在正常人表皮表達(dá)較弱，免疫組化(×200)圖 2 a： caspase-1表達(dá)于銀屑病皮損處表皮全層，呈強(qiáng)陽性 ，免疫組化(×200)； b： caspase-1表達(dá)于正常人表皮中、下部，且染色強(qiáng)度弱，免疫組化(×200)Fig. 1 a:Immunohistochemical staining of ASC in psoriasis vulgaris patients(×200); b: Immunohistochemical staining of ASC in epidermis of normal persons(×200)Fig. 2 a: Immunohistochemical staining of caspase-1 in psoriasis vulgaris patients(×200); b: Immunohistochemical staining of caspase-1 in epidermis of normal persons(×200)

NLRP3炎癥小體是近年來引起關(guān)注的一種固有免疫系統(tǒng)的胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體，是由NLRP3、接頭蛋白ASC、半胱氨酸蛋白酶前體procaspase-1共同形成的功能性多蛋白復(fù)合體。NLRP3炎癥小體作為固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的重要聯(lián)系，通過識(shí)別內(nèi)源性與外源性危險(xiǎn)信號(hào)，參與啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。ATP、ROS、紫外線、微生物及其產(chǎn)物等促使NLRP3在胞漿內(nèi)寡聚并募集ASC和前caspase-1，前caspase-1自活化形成caspase-1，裂解前IL-1β和前IL-18為有活性的IL-1β和IL-18[6]。IL-1β 和IL-18同屬IL-1家族，被認(rèn)為在銀屑病等炎癥性皮膚病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[7]。IL-1β和IL-18調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)IL-17產(chǎn)生，同時(shí)誘導(dǎo)IFNγ的產(chǎn)生。此外NLRP3炎性小體還參與、促進(jìn)初始T細(xì)胞形成Th1和Th17效應(yīng)細(xì)胞，從而參與銀屑病發(fā)病過程[1-8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銀屑病皮損處ASC和caspase-1在表皮全層強(qiáng)陽性表達(dá)，ASC在正常對(duì)照組雖然全層表達(dá)，但染色強(qiáng)度較弱；而caspase-1在正常對(duì)照組僅表達(dá)在基底層細(xì)胞和棘細(xì)胞層下部。國外研究亦顯示，銀屑病皮損處ASC和caspase-1表達(dá)增強(qiáng)，caspase-1的活化以及之后的IL-1β和IL-18的產(chǎn)生、分化、成熟對(duì)于銀屑病的炎癥過程具有關(guān)鍵作用[7-9]。高表達(dá)的ASC和caspase-1提示銀屑病皮損中NLRP3炎癥小體活性增強(qiáng)，NLRP3炎癥小體通過誘導(dǎo)IL-1β、IL-18的合成，啟動(dòng)了Th1和Th17細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了銀屑病的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)也提示角質(zhì)形成細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞參與了發(fā)病過程[10]。新近研究還發(fā)現(xiàn)NLRP3基因rs10733113位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與銀屑病的遺傳易感性相關(guān)，該發(fā)現(xiàn)支持固有免疫在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[3]。

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