侯永微，紀(jì)小龍，王美娥遼寧醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)，遼寧錦州 00；武警總醫(yī)院 病理科，北京 00039

原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并已在各系統(tǒng)的正常及病變的細(xì)胞膜形態(tài)的探索上取得了很多成果[1-2]。目前臨床免疫組織化學(xué)過(guò)程中出現(xiàn)的假陽(yáng)性、假陰性、共同表達(dá)、例外表達(dá)等問(wèn)題的進(jìn)一步解釋亟需抗原及抗體高分辨率的成像。因此，抗體分子的成像也是AFM研究的熱門(mén)內(nèi)容，并可間接了解相應(yīng)抗原的形態(tài)，為抗原-抗體結(jié)合提供直觀的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。本文應(yīng)用AFM觀察常用的7種鼠抗人單克隆抗體的形態(tài)，初步探討不同抗體形態(tài)的相對(duì)特異性。

材料和方法

1 試劑和儀器 近1個(gè)月內(nèi)中杉金橋公司制備的7種鼠抗人單克隆抗體(廣譜細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、白細(xì)胞共同抗原、S100蛋白、細(xì)胞角蛋白7、Dog-1、甲狀腺球蛋白)的工作液。ECLIPSE TE2000-U倒置相差顯微鏡(購(gòu)自日本NIKON公司)；Nanoscope Ⅲa型原子力顯微鏡(購(gòu)自Digital Instruments Inc，Santa Barbara，CA)，采用氮化硅(Si3N4)懸臂，SNL-10型針尖(contact模式)，微懸臂長(zhǎng)85 μm，力常數(shù)2.5 N/m，探針針尖曲率半徑為20~30 nm，X軸掃描256線。

2 制備掃描樣本 先將載玻片(單頭單面硅化黏附載玻片)用記號(hào)筆圈定直徑為1.5 cm的圓形范圍，將上述7種鼠抗人單克隆抗體的工作液分別滴加于載玻片上并均勻鋪于圓形范圍內(nèi)，每張載玻片滴加1滴，將載玻片放入加有10%中性緩沖甲醛的濕盒內(nèi)，置于37 ℃，1 h后，取出載玻片，于蒸餾水中輕輕涮洗1 min，取出，置于超凈工作臺(tái)(上海錦屏儀器儀表有限公司，型號(hào)為SW-CJ-3)中晾干以備掃描。依上述方法同時(shí)制備不滴加任何抗體的空白載玻片作為對(duì)照。

3 AFM掃描7組樣品 載玻片晾干后置于AFM載物臺(tái)上，利用Nikon倒置顯微鏡觀察抗體的分布情況，選取分散較好，呈點(diǎn)狀均勻分布的區(qū)域，在操作軟件中選擇contact模式進(jìn)行掃描。每組掃描10張樣本片，每張掃描10個(gè)部位，每個(gè)部位按100 μm-50 μm-20 μm-10 μm-5 μm-1 μm范圍依次進(jìn)行掃描，掃描頻率為0.5 Hz，空氣濕度50%，溫度25 ℃。觀察各組抗體形態(tài)的差異，并利用AFM圖像分析系統(tǒng)對(duì)掃描顆粒的寬度、最大峰高度和平均粗糙度進(jìn)行定量測(cè)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，7組樣品的寬度(width)、最大峰高度(maximum height)、平均粗糙度(mean roughness)以-x±s表示，方差分析， P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 倒置相差顯微鏡觀察 抗體沉淀黏附法制備的樣品在倒置相差顯微鏡下觀察時(shí)背景干凈、抗體分散度較好，利于AFM的掃描。

2 AFM掃描成像 1)細(xì)胞角蛋白鼠抗人單克隆抗體的2D圖像見(jiàn)長(zhǎng)桿狀物質(zhì)，由多個(gè)小類圓形物組合在一起，也有部分比圖A所示更加長(zhǎng)而窄，部分呈類橢圓形；在3D圖像上突起似幾座山峰連在一起(圖1)。2)波形蛋白鼠抗人單克隆抗體的2D圖像見(jiàn)類圓形但局部不規(guī)則的物質(zhì)，中心最亮，四周稍暗；3D圖像上見(jiàn)高低起伏的突起，中間最高，四周環(huán)繞稍低的突起，如幾座小山峰圍繞一座主峰(圖1)。3)白細(xì)胞共同抗原鼠抗人單克隆抗體的2D圖像中見(jiàn)由多個(gè)大小不一、形狀不規(guī)則形物質(zhì)組成類圓形，且表面明暗不一；3D圖像中見(jiàn)突起高低起伏，中間最高。4)S100蛋白鼠抗人單克隆抗體的2D掃描圖中見(jiàn)不規(guī)則長(zhǎng)條形結(jié)構(gòu)，明暗不一；3D圖像中見(jiàn)不規(guī)則長(zhǎng)形突起，表面凹凸不平，由多個(gè)大小不等的突起組成。5)Dog-1鼠抗人單克隆抗體的2D圖像中見(jiàn)類圓形的物質(zhì)，明暗不一致；3D圖中可見(jiàn)不規(guī)則突起，似“山包”，表面凹凸不平，為多個(gè)小“山包”組成。6)細(xì)胞角蛋白7鼠抗人單克隆抗體的黏附載玻片上掃描的2D圖中可見(jiàn)類圓形物質(zhì)，亮度較一致；3D掃描圖見(jiàn)半球形“山包”狀突起。7)甲狀腺鼠抗人單克隆抗體的2D圖像中可見(jiàn)三角形物質(zhì)，明暗不一，由多個(gè)不規(guī)則形物質(zhì)組成；3D圖像見(jiàn)突起呈三角錐形，表面凹凸起伏(圖1)。

3 各組單克隆抗體形態(tài)的參數(shù)分析 廣譜細(xì)胞角蛋白鼠抗人單克隆抗體為長(zhǎng)桿狀，其寬度明顯大于其他6組(P＜0.05)，Dog-1鼠抗人單克隆抗體的寬度大于細(xì)胞角蛋白7(P＜0.05)，其他各組間單克隆抗體的寬度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；細(xì)胞角蛋白7鼠抗人單克隆抗體的最大峰高度大于廣譜細(xì)胞角蛋白、甲狀腺球蛋白、Dog-1鼠抗人單克隆抗體(P＜0.05)，Dog-1鼠抗人單克隆抗體的最大峰高度大于白細(xì)胞共同抗原鼠抗人單克隆抗體(P＜0.05)，其他各組間單克隆抗體的最大峰高度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；各組間平均粗糙度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

圖 1 三種具有代表性形態(tài)的單克隆抗體2D與3D圖Fig. 1 2D and 3D of 3 monoclonal antibodies with representative morphologies

表1 7組單克隆抗體寬度、最大峰高度、平均粗糙度的比較Tab. 1 Width, maximum height and mean roughness of 7 monoclonal antibodies

討 論

目前常用的基質(zhì)材料有云母、二氧化硅、金屬、聚苯乙烯等[3]。本實(shí)驗(yàn)顯示黏附載玻片可以作為AFM掃描中方便實(shí)用的材料之一。甲醛是公認(rèn)的組織細(xì)胞固定液，有保持細(xì)胞形態(tài)、保護(hù)蛋白的作用，而乙醇會(huì)使細(xì)胞變性，丙酮會(huì)使細(xì)胞萎縮變性[4]。由于10%甲醛溶液中含不規(guī)則形的顆粒，因此本研究用10%中性緩沖甲醛的蒸汽固定法保持抗體形態(tài)[5]。

細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)是細(xì)胞骨架蛋白中最為復(fù)雜的中間絲，它由30多種不同的基因編碼，可以轉(zhuǎn)錄成20多種不同的多肽，主要表達(dá)在各種上皮細(xì)胞中。AE1/AE3是廣譜抗細(xì)胞角蛋白抗體，是AE1克隆與AE3克隆的混合[6]；用于上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞來(lái)源腫瘤的標(biāo)記?？寺E1識(shí)別Ⅰ型細(xì)胞角蛋白CK10、CK15、CK16、CK19；克隆AE3識(shí)別CK1、CK2、CK3、CK5、CK6及CK8。不同公司的廣譜抗細(xì)胞角蛋白抗體識(shí)別的種類并不完全一致。而掃描出來(lái)的廣譜CK抗體形態(tài)并不單一也說(shuō)明了此抗體是多種單克隆抗體的混合液。

應(yīng)用原子力顯微鏡對(duì)各組單克隆抗體平均粗糙度的觀察測(cè)量得出各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與細(xì)胞之間測(cè)量的結(jié)果不同，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間表面的平均粗糙度可得出明顯的差異[2]。癌細(xì)胞膜表面粗糙度增加與其抗體表達(dá)的種類和數(shù)量有關(guān)，如Kaul-Ghanekar等[7]發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常相鄰近的組織切片，SMAR1表達(dá)減低的人類乳腺癌組織切片的表面粗糙度增高，然而不同種類抗體本身的平均粗糙度是否有明顯差異需進(jìn)一步研究。

目前，對(duì)于抗原-抗體之間作用力的研究較多，而對(duì)于特異性抗體形態(tài)的研究較少[8-9]。本實(shí)驗(yàn)中用AFM掃描的7種單克隆抗體中形態(tài)各不相同，但其2D形態(tài)圖大其致可分為三種：類圓形、不規(guī)則長(zhǎng)桿形和三角形。對(duì)于更多抗體的掃描將會(huì)觀察到更多特異的形態(tài)。這在形態(tài)上直觀地印證了不同抗體的多態(tài)性及每種抗體具有相對(duì)特異性。在不同種類及不同分化階段的細(xì)胞中表達(dá)的抗原是不同的，明確抗體的特異形態(tài)對(duì)各種抗體形態(tài)的觀察為在少量細(xì)胞情況下，滴加相應(yīng)抗體進(jìn)行AFM掃描來(lái)判斷細(xì)胞種類、分化程度及其與癌癥的關(guān)系提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)7種單克隆抗體形態(tài)的觀察，我們初步認(rèn)為，抗原-抗體結(jié)合如鎖-鑰匙的關(guān)系，應(yīng)是一一對(duì)應(yīng)的，但當(dāng)某些抗體的形態(tài)極為相似時(shí)，也有可能會(huì)同時(shí)與兩種抗原結(jié)合，即出現(xiàn)一把鑰匙開(kāi)兩把鎖的情況，這是“例外表達(dá)”的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。AFM對(duì)更多抗體納米級(jí)形態(tài)的觀察分析將對(duì)細(xì)胞抗原的共同表達(dá)及例外表達(dá)提供更加客觀的解釋。

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