李云奇，肖 毅，董金凱，王 偉，田仁禮，殷小濤，林曉亮，于繼云，高江平解放軍總醫(yī)院 泌尿外科，北京 10085；軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，北京 100850；解放軍第07醫(yī)院 泌尿外科，北京 100071

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是腎臟惡性程度較高的腫瘤之一，也是泌尿系常見的腫瘤。過去30年中腎細胞癌的發(fā)病率逐年上升[1-3]。病人確診時已經(jīng)到了晚期，同時在行根治性切除術后的腎癌中也有20%~30%會發(fā)生轉移，對于失去手術機會的RCC目前還沒有令人滿意的治療方法[4-5]。因為它的免疫原性很高，對放化療都不敏感，所以免疫治療的方法作為一種新的治療手段被給予了厚望，成為研究熱點[6-8]。

本實驗利用PCR技術擴增出人RCC細胞上一種膜表達抗原G250的全長基因，根據(jù)DNA重組技術將其定向插入到pIRES-neo真核表達載體中。通過脂質體轉染的方法，導入renca細胞中，經(jīng)過G418的加壓，建立可以穩(wěn)定表達人G250基因的小鼠renca細胞株，為后續(xù)腎癌疫苗的免疫應答奠定了基礎。

材料和方法

1 主要材料及試劑 大腸埃希菌DH5α和小鼠renca細胞為本實驗室保存，pIRES-neo真核表達載體購自Clontech公司，T4DNA連接酶，高保真PyrobestTMExTaq聚合酶是TaKaRa公司的產品，G418，PCR所用的酶及dNTP購自北京全式金生物技術有限公司，RT-PCR是toyobo公司產品，兔抗人一抗購自Santa cruz公司，F(xiàn)ITC標記的二抗購自北京中橋技術有限公司，細胞培養(yǎng)用的RPMI1640來自Thermo公司，胎牛血清來自Hyclone公司，研究所用引物由Invitrogen公司合成，lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司。轉染用小提試劑盒是北京天根生物技術有限公司產品，凝膠回收試劑盒，質?；厥赵噭┖袨楸本┤┻h志產品。

2 人G250基因的擴增 以我們實驗室前期構建的含有G250基因載體的質粒為模板，PCR擴增G250基因。反應體系參照EXTaq酶的說明書，50 μl，反應條件是95 ℃，預變性6 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共擴增出32個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。擴增引物，上游引物：GCAATTG CAGAGGTTGCCGGATGCAG；下游引物：GAGATC TCTAGGCTAGTCTCGGCTAC。引物是由Invitrogen生物技術有限公司合成。

3 人G250真核表達載體的構建 首先將PCR產物進行切膠回收純化，和pIRES-neo真核表達載體質粒進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收純化，T4DNA連接酶連接后轉化入大腸埃希菌DH5α，挑出陽性克隆進行雙酶切和PCR鑒定，將分析正確的陽性克隆質粒進行保存，并且命名為pIRES-neo-G250。

4 細胞轉染及克隆篩選 首先做預實驗，以10 d殺死全部未轉染renca細胞G418的最低濃度為最終篩選濃度，結果確定實驗G418篩選濃度為600 mg/L。在轉染的前1 d，取對數(shù)生長期的renca細胞，用胰酶消化后接種于六孔板中，當細胞匯合度達到60%~70%時，將提取的轉染質粒pIRES-neo-G250和空載體pIRES-neo在LipofectamineTM2000的介導下轉染入renca細胞，方法按照LipofectamineTM 2000說明書。在48 h之后，將六孔板中細胞用胰酶消化，以1∶3的比例傳代，56 h后，按每瓶600 mg/L終濃度加入G418。約7 d，細胞出現(xiàn)大量死亡，此時每隔1 d換1次液，持續(xù)加壓到細胞不再死亡且以團簇生長為止。

5 Western blotting檢測G250蛋白表達 取對數(shù)生長期的細胞，提取細胞蛋白質變性加熱后，10%的SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉Tris鹽溶液室溫震蕩封閉2 h。1∶500稀釋的人G250抗體作為一抗，1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG作為二抗，分別孵育后進行顯影定影。

6 流式細胞儀和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測 取對數(shù)生長期的細胞，用預冷的含2%的新生牛血清的PBS清洗細胞3次，實驗組和對照組細胞同時用兔抗人的一抗4 ℃孵育40 min，含2%的新生牛血清的PBS清洗細胞3次后，同時加入FITC標記的二抗山羊抗兔IgG，4 ℃孵育40 min，2%的新生牛血清的PBS清洗細胞3次后，進行流式細胞術檢測，將檢測后的renca細胞進行滴片后激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

結 果

1 人G250真核表達載體的構建及鑒定 重組真核表達質粒pIRES-neo -G250用EcoRI和BamHI雙酶切后呈現(xiàn)約1 100 bp和5 500 bp左右的兩條目條帶，與預期大小一致。將鑒定正確的質粒送到Invitrogen生物技術有限公司測序，結果與當初預計的基因序列完全相同，說明構建的質粒正確。見圖1。

圖 1 pIRES-neo-G250酶切電泳圖M： DL2000標志物； 1： pIRES-neo質粒； 2： 酶切后質粒Fig. 1 Enzyme digestion electrophoresis of pIRES-neo-G250 M：DL 2000 maker; lane 1：pIRES-neo plasmid; lane 2： products after restriction enzyme digestion(EcoRI/BamHI)

圖 2 Western blotting檢測結果 1：轉染pIRES-neo -G250；2： 轉染pIRES-neoFig. 2 Western blotting showing pIRES-neo-G250 in experiment group (1) and pIRES-neo in control group (2)

2 Western blotting檢測G250蛋白表達 穩(wěn)定轉染pIRES-neo-G250的renca細胞能夠檢測到G250的蛋白條帶，而對照組則沒有相應的條帶，用GADPH作為內參，與預期一致。見圖2。

圖 3 流式細胞圖分析 A： 轉染pIRES-neo； B： 轉染pIRES-neo -G250Fig. 3 Flow cytometry showing pIRES-neo and pIRES-neo-G250 in control group (A) and experiment group (B)

圖 4 激光共聚焦檢測 A，B： 轉染pIRES-neo； CD： 轉染pIRES-neo -G250； AC： 熒光圖； BD： 明場圖Fig. 4 Immunofluorescence confocal assay showing pIRES-neo in control group (A, B) and pIRES-neo-G250 in experiment group (C, D)

3 Renca細胞的流式細胞術和激光共聚焦檢測流式細胞術(圖3)和激光共聚焦顯微鏡(圖4)檢測結果顯示，穩(wěn)定轉染pIRES-neo-G250的renca細胞用特異性抗體檢測得到了高效的熒光表達，而對照組則沒有。

討 論

G250是一種膜表達抗原，它與具有碳酸酐酶活性的細胞黏附因子-碳酸酐酶9(MN/CA IX)的基因結構完全相同，因此命名為G250- MN/CA IX，簡稱G250。它是碳酸酐酶家族成員之一，基因位于染色體9p12-13上[9-10]。因為它表達與腎透明細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)細胞上的跨膜抗原表位，可以與G250抗體結合，顯示有大多數(shù)的腎透明細胞癌和其他類型的腎透明細胞癌都有G250的表達，而在正常組織中很少或根本不表達[11-12]。所以它在RCC細胞中的這種特性使它成為腫瘤疫苗潛在的靶抗原和腫瘤治療的重要靶位[13-14]。G418是一種氨基糖苷類抗生素，它通過抑制轉座子Tn601，Tn5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質合成，對原核和真核等細胞產生毒素。當neo基因被整合進真核細胞DNA后，則能啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA，從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達，使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長，大大降低了篩選的時間[15-16]。

為了驗證此細胞株穩(wěn)定表達G250的能力，筆者又對其反復凍存和復蘇以及連續(xù)傳代后的細胞進行了檢測，能夠達到預期目標。綜上所述，我們成功構建了pIRES-neo-G250真核表達載體，轉染及篩選了穩(wěn)定表達G250的細胞株。為進一步研究以人G250為靶抗原構建的腎癌基因疫苗提供了很好的細胞株，同時也為G250在腎癌免疫治療中的應用奠定了基礎。

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