周 任

（廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院肝膽外科 537000）

肝癌是一種臨床常見的惡性腫瘤，其死亡率在消化系統(tǒng)腫瘤中僅次于胃癌和食管癌，位居第3，并且發(fā)病率在中國逐漸升高，嚴(yán)重影響了人民群眾的身體健康［1］。連接蛋白（Cx）是由連接基因家族編碼的一組蛋白質(zhì)，其作為細胞間隙連接通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，參與細胞生長到死亡的全部生命過程，具有重要的調(diào)控作用［2］。研究表明肝癌與Cx表達異常有關(guān)，但是具體的機制還不太清楚［3］。因此，了解間隙連接基因Cx32的調(diào)節(jié)機制，恢復(fù)正常表達是目前抗腫瘤研究的熱點之一［4］。本文為此應(yīng)用蛋白雜交，RT－PCR分別檢肝細胞癌、肝炎組織和正常肝組織中Cx32蛋白及Cx32mRNA水平，以探討間隙連接基因Cx32在肝細胞癌與肝炎中的表達意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本和試劑 收集本院2008年2月至2011年3月30例肝細胞癌及30例肝炎標(biāo)本，都為外科手術(shù)切除標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實。所有病例術(shù)前均未經(jīng)過放療和化療。其中，男40例，女20例，年齡28～62歲，平均（45.25±8.24）歲。30例正常肝組織標(biāo)本為同期醫(yī)院收治的外科外傷性肝破裂患者的手術(shù)切除標(biāo)本，并除外其他肝臟疾病，其中，男20例，女10例，年齡25～60歲，平均（45.85±6.82）歲。所有標(biāo)本取下后用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，均在離體后0.5h內(nèi)置入－196℃的液氮中保存。試劑：Cx32鼠抗人單克隆抗體（美國zymed公司），β－actin鼠抗人單克隆抗體（美國Sigma公司），ECL試劑盒（Pharmacia公司），Trizol（美國 MRC公司），AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），PCR引物（大連寶生物工程公司），Taq酶（大連寶生物工程公司）。

1.2 引 物 設(shè) 計 Cx32上 游 引 物：5′－CAG CTT GTT GAT CTC ATT CTG C－3′，下游引物：5′－GCA TCA TCC TCA ATG TGG C－3′，目的片段長度 150bp；β－actin上游引物：5′－ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A－3′，下 游 引 物：5′－CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA－3′，目的片段長度318bp。

1.3 蛋白雜交分析 用RIPA buffer提取蛋白質(zhì)，DC protein assay法測定總蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)行SDS－PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉后，加鼠抗人Cx32單克隆抗體（1∶500），HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶10 000），ECL試劑盒檢測Cx32蛋白信號。Bandscan9.0軟件進行灰度值掃描分析。

1.4 RT－PCR分析 分別取上述3種組織50～100mg于勻漿器內(nèi)，加1mL Trizol反復(fù)抽吸勻漿，裂解后倒入1.5mL EP管內(nèi)；加入氯仿0.2mL，劇烈搖擺15s后置于室溫下10min；4℃離心，12 000r／min離心15min；取上層液相置于另一1.5 mL EP管內(nèi)；加入0.5mL異丙醇混勻，室溫下放105min；4℃離心，12 000r／min離心10min，棄去上清液；加入75%乙醇1mL，混勻后4℃離心，12 000r／min離心5min；棄去上清，將EP管倒置，干燥10min左右；加入20μL DEPC水溶解；按照常規(guī)方法進行反轉(zhuǎn)錄。按以下配制PCR反應(yīng)液（總反應(yīng)體系50μL）：5×PCR Buffer 10μL，滅菌蒸餾水28.75μL，TaKa－Ra ExTap 0.25μL，上、下游特異性引物各0.5μL和cDNA 10 μL。放入PCR儀內(nèi)，按以下條件進行PCR擴增，退火溫度為58℃，延伸時間1min。同時擴增內(nèi)標(biāo)物：GAPDH。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5～10μL反應(yīng)產(chǎn)物行0.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外線下成像。用Bandscan5.0軟件進行灰度掃描分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，所有結(jié)果以表示，計量均數(shù)資料比較用方差分析，有顯著差異者再進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白雜交結(jié)果 灰度掃描與灰度值結(jié)算結(jié)果分析顯示肝癌組織Cx32蛋白雜交產(chǎn)物灰度值顯著低于正常肝組織（P＜0.01），并顯著低于肝炎組織（P＜0.05）。具體情況見表1。

表1 3組間Cx32蛋白雜交檢測產(chǎn)物灰度值比較

表1 3組間Cx32蛋白雜交檢測產(chǎn)物灰度值比較

組別 n Cx32正常肝組織30 0.951±0.06肝炎組織 30 0.750±0.05肝細胞癌組織 30 0.530±0.10 F 12.362 P 0.000

2.2 RT－PCR結(jié)果 灰度掃描與灰度值結(jié)算結(jié)果分析顯示Cx32mRNA肝細胞癌組織、肝炎組織及正常肝臟中的表達含量類似，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具體情況見圖1與表2。

表2 3組間Cx32蛋白RT－PCR檢測產(chǎn)物灰度值比較

表2 3組間Cx32蛋白RT－PCR檢測產(chǎn)物灰度值比較

組別 n Cx32／β－actin正常肝組織30 1.15±0.15肝炎組織 30 1.36±0.14肝細胞癌組織 30 1.24±0.08 F 0.625 P 0.963

圖1 Cx32蛋白RT－PCR檢測產(chǎn)物圖

3 討 論

連接蛋白是由連接蛋白基因家族編碼的一組蛋白質(zhì)，它們在不同的細胞、組織、器官以及其不同發(fā)育時期的表達都有所不同［5］。同一種細胞也可有表達幾種不同的連接蛋白，同一組織與器官也可以包含多種連接蛋白，它們是構(gòu)成細胞間隙連接主要組成成分，廣泛存在于多細胞動物間，是細胞間隙連接通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［6］。

近年的研究顯示，腫瘤組織中常伴有細胞間隙連接通訊的異常，主要表現(xiàn)為腫瘤細胞的同型細胞間隙連接通訊減少，從而使腫瘤細胞脫離機體的調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤無限增殖［7－8］；另一方面，通過共同培養(yǎng)、藥物干預(yù)可使連接蛋白表達得到恢復(fù)，從而可抑制腫瘤生長［9］。有研究表明Cx基因表達不僅受到甲基化調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)作用還受到糖皮質(zhì)激素、轉(zhuǎn)錄因子等的影響［10］。而基因異常甲基化是癌變的早期事件，可望通過藥物干預(yù)恢復(fù)正常甲基化模式，從而達到防治腫瘤的目的。最新研究顯示胞間隙連接蛋白Cx32、Cx43蛋白表達明顯受抑，且隨肝細胞肝癌惡性程度的升高而表達逐級遞減，與肝細胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)，Cx32mRNA、Cx43mRNA在肝細胞肝癌組織和正常肝組織中均無明顯的變化，提示肝癌細胞Cx32、Cx43基因表達過程中轉(zhuǎn)錄正常，而在翻譯或翻譯后蛋白質(zhì)加工、修飾過程存在異常。Cx43蛋白酪氨酸磷酸化作用，使細胞間間隙連接通訊功能受到抑制，胞內(nèi)第二信使游離鈣濃度（［Ca2＋］i）的改變是該信使系統(tǒng)反應(yīng)的關(guān)鍵。系統(tǒng)、全面地揭示肝細胞肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要分子機制，探討肝細胞癌早期診斷和判斷預(yù)后的有效指標(biāo)，并開辟肝細胞癌基因治療的新途徑［11］。在前人的Cx32免疫組織化學(xué)實驗中，也發(fā)現(xiàn)Cx32蛋白在肝細胞癌組織的表達低于肝炎組織及正常肝臟中［12］。

本實驗結(jié)果顯示，肝癌組織Cx32蛋白雜交產(chǎn)物灰度值顯著低于正常肝組織（P＜0.01），并顯著低于肝炎組織（P＜0.05）。而肝炎組織和正常肝組織中該蛋白無明顯差異，提示肝細胞癌中Cx32蛋白表達的減少可能是肝細胞癌發(fā)生的重要機制之一。同時結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Cx32mRNA在肝細胞癌組織、肝炎組織及正常肝臟中的表達含量類似，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示肝細胞癌中Cx32蛋白缺失可能是Cx32基因在翻譯或蛋白質(zhì)的加工修飾過程中異常所致。

總之，Cx32基因作為抑癌基因，在肝癌組織中Cx32蛋白表達下調(diào)，可能是肝癌組織的重要機制之一，而Cx32蛋白缺失可能與Cx32基因在轉(zhuǎn)錄后的翻譯或翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾過程異常相關(guān)。

［1］ 楊建秀，于衛(wèi)中，王洪智，等.彩色多普勒超聲和螺旋CT對小肝癌的診斷價值［J］.臨床醫(yī)學(xué)，2004，24（1）：26.

［2］ 鄭可國，沈靜嫻，趙志清，等.螺旋CT雙期動態(tài)掃描對小肝癌的診斷價值［J］.影像診斷與介入放射學(xué)，2004，13（4）：207.

［3］ Kawasaki Y，Omori Y，Li Q，et al.Cytoplasmic aberration of connexin32expands cancer stem cell population in human HuH7hepatoma cells by enhancing its self－renewal［J］.Int J Cancer，2011，128（1）：51－62.

［4］Jee H，Nam KT，Kwon HJ，et al.Altered expression and localization of connexin32in human and murine gastric carcinogenesis［J］.Dig Dis Sci，2010，17（2）：55－56.

［5］ King TJ，Lampe PD.Mice deficient for the gap junction protein connexin 32exhibit increased radiation－induced tumorigenesis associated with elevated mitogen－activated protein kinase（p44／Erk1，p42／Erk2）activation［J］.Carcinogenesis，2009，25（5）：669－680.

［6］ Lin FL，Chang CI，Chuang KP，et al.Advanced glycation end products down－regulate gap junctions in human hepatoma SKHep 1cells via the activation of Src－dependent ERK1／2and JNK／SAPK／AP1signaling pathways［J］.J Agric Food Chem，2010，58（15）：8636－8642.

［7］ Wong XIN，Orris LO，Winnie Y，et al.Frequent P15promoter methylation in tumor and peripheral blood from hepatoeellular carcinoma patients［J］.Clin Cancer Res，2010，6（2）：3516－3521.

［8］ Okoehi O，Hibi K，Sakai M，et al.Methylation mediated silencing of SOCS－1gene in hepatocellular carcinoma derived from cirrhosis［J］.Clin Cancer Res，2003，9（14）：5295－5298.

［9］ Tcbou JC，Lin X，F(xiàn)reije D，et al.GSTP1CpG island DNA hypermethylation in hepatocellular carcinomas［J］.Int J Oncol，2000，16（4）：663－676.

［10］Fujie Y，Yamamoto H，Ngan CY，et al.Oxaliplatin，apotent inhibitor of surviving，enhances paclit axel induced apoptosis and mitotic catastrophe in colon cancer cells［J］.Jpn J Clin Oncol，2009，35（8）：453－463.

［11］Zaffaroni N，Pennati M，Daidone MG.Survivin as a target for new anticancer interventions［J］.Cell Mol Med，2010，9（2）：360－372.

［12］Ahieri DC.Validating survivin as a cancer therapeutic target［J］.Nat Rev Cancer，2011，3（1）：46－54.