于 游，張才全

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科 400016）

Id蛋白［1］又稱為分化抑制因子（inhibitor of differentiation，Id），是新的準原癌基因［2］，在多種腫瘤中有異常的表達，參與了腫瘤細胞增殖、凋亡、浸潤、遷移以及腫瘤血管生成等多方面相關行為的調(diào)控［3－8］。Id1在結(jié)腸癌組織中表達明顯高于正常組織及結(jié)腸癌旁組織［9］，故研究Id1與結(jié)腸癌的關系，對于進一步闡明結(jié)腸癌的生物學行為以及治療將會有積極意義。本研究在體外過表達及抑表達Id1情況下檢測結(jié)腸癌HT－29細胞血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA和蛋白的表達情況以及腫瘤細胞增殖情況，以探討Id1在結(jié)腸癌細胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 Id1一抗購于Miliipore公司；山羊抗兔二抗購于北京中杉生物有限公司；RNA提取試劑盒購于Takara公司；RT－PCR試劑盒購自Tiangen公司；Trisbase購于上海生工生物工程有限公司；EXTaq酶購于Takara公司；dNTP購于Takara公司；VEGF一抗購于 Miliipore公司；脂質(zhì)體ipofect amine 2000購于Invitrogen公司；Id1基因的特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）Si－Id－1－001（19bp）［10］由廣州銳博生物公司設計與合成，各自的正義和反義序列分別為：正義鏈5′－UGA GCA AGG UGG AGA UUC U dTdT－3′，反義鏈3′－dTdT ACU CGU UCC ACC UCU AAG A－5′。

1.2 細胞培養(yǎng)與Id1過表達及抑表達質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 人結(jié)腸癌細胞（human colon cancer cells，HT－29）株由中科院上海細胞庫提供；HT－29經(jīng)復蘇后，常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生小牛血清，青霉素（100U／mL），鏈霉素（100μg／mL）的1640培養(yǎng)基中。Id1全長基因擴增Id1：上游引物：5′－TAA CTG TTC CAT TTT CCG TA－3′，下游引物：5′－TTA CCA CCA TCT AAA TTA TTT G－3′，擴增長度：975bp，退火溫度：60℃，采用 Pfu保真酶擴增。PCR擴增Id1片段，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和NotI將其連接至載體pGEx－4T－1，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后測序。轉(zhuǎn)染前1d，將2.5×105個細胞／孔接種于6孔培養(yǎng)板。過表達分為3組：空白組：僅加培養(yǎng)血清；對照組：空載體，轉(zhuǎn)染無義序列；過表達組：轉(zhuǎn)染Id1過表達質(zhì)粒。抑表達分為3組：空白組：僅加培養(yǎng)血清；對照組：空載體，轉(zhuǎn)染無義序列；抑表達組：轉(zhuǎn)染Id1－siRNA。各組均在37℃，1%O2，99%N2，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后進行轉(zhuǎn)染，實驗參照Lipofect amine 2000產(chǎn)品說明書進行操作。待細胞轉(zhuǎn)染48h后，分別用TRlzol和RIPA裂解液提取細胞總RNA和細胞總蛋白。

1.3 RT－PCR檢測VEGF mRNA 參照Trlzo試劑盒說明書提取各組細胞總的 RNA。VEGF上游引物：5′－GGG CAG AAT CAT CAC GAA GT－3′，下游引物：5′－GAT GTA CTC GAT CTC ATC AGG GT－3′，擴增長度：117bp，退火溫度：60℃。反應體系：1×PCR Buffer，dNTP 0.2mmol／L，cDNA 模板200ng，引物濃度0.4μmol／L，Taq酶1.25U，反應總體積25μL。按照RT－PCR試劑盒進行PCR擴增：1μL DNA樣本作為PCR擴增模板，陰性對照擴增模板為去離子水；擴增條件為95℃預變性2min；隨后95℃10s，退火溫度15s，72℃ 延伸45s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10min。實驗重復3次，取其平均值。

1.4 Western檢測Id1、VEGF蛋白 用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白后，用Western檢測Id1、VEGF蛋白。每106個細胞加入500L細胞裂解液，冰上放置30min裂解細胞，12 000r／min離心20min，收集上清液，測定提取的總蛋白濃度。取等量蛋白樣品50g進行8%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，分別與Id1、VEGF多克隆抗體（濃度為1∶1 500）4℃反應過夜及相應的羊抗兔二抗（濃度為1∶3 000）反應，加入化學發(fā)光劑ECL反應，顯色，密度掃描分析。實驗重復3次，取其平均值。

1.5 MTT實驗 取各組對數(shù)生長期的HT－29細胞，以每孔103接種于96孔板內(nèi)，加入條件培養(yǎng)基。在第1～8天，每天每種條件培養(yǎng)基的細胞各取出3孔加入 MTT溶液（5g／L）20 μL，繼續(xù)37℃孵育4h后，吸棄培養(yǎng)上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩10min。在ELISA檢測儀上測定各孔的A490nm值。以時間為橫坐標，3復孔的平均光吸收值為縱坐標，繪制HT－29細胞生長曲線。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

兩組Id1過表達與抑表達VEFG mRNA和VEGF蛋白的結(jié)果見表1及圖1。干擾后兩組MTT結(jié)果見圖2～3。

圖1 Id1對VEGF蛋白的表達電泳圖

表1 Id1過表達與抑表達VEGF mRNA和VEGF蛋白表達結(jié)果比較

表1 Id1過表達與抑表達VEGF mRNA和VEGF蛋白表達結(jié)果比較

▲：P＜0.05，與各自對照組比較。

組別蛋白空白組 0.002 99±0.000 69 0.132 00±0.035 10 0.006 16±0過表達VEGF mRNA VEGF 蛋白抑表達VEGF mRNA VEGF.000 83 0.450 00±0.039 30對照組 0.003 49±0.001 34 0.131 00±0.053 00 0.006 26±0.000 45 0.464 00±0.023 10過表達組 0.031 30±0.006 05▲ 0.245 00±0.032 60▲ 0.002 30±0.000 31▲ 0.231 00±0.027 30▲

圖2 過表達3組生長曲線

圖3 抑表達3組生長曲線

3 討 論

結(jié)腸癌發(fā)生不僅是癌細胞不斷增殖的過程，也是癌細胞分化不斷抑制的過程，結(jié)腸癌細胞的惡性程度與分化程度密切相關。細胞的分化程度提示腫瘤的良、惡性，并直接影響其預后。Id1負性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制細胞分化，從而促進細胞增殖［11］。目前確定在20多種人類腫瘤中均有Id1過表達，提示Id1在腫瘤的發(fā)生過程中可能起重要作用，可將其作為這些腫瘤的一個新標志物［12］。敲除Id1基因的荷瘤小鼠身上發(fā)現(xiàn)腫瘤不能生長和轉(zhuǎn)移，顯示出廣泛壞死和少血管，血管缺乏分枝出芽。在胰腺腫瘤組織中，Idl的表達水平越高，腫瘤中的血管密度指數(shù)也就越高，都提示Idl的表達和腫瘤的血管發(fā)生密切相關［13］。對前列腺腫瘤進行的研究也發(fā)現(xiàn)同類現(xiàn)象［14］。在消化系統(tǒng)的腫瘤中，Id1在結(jié)腸癌、胰腺癌中的表達也異常增高，Id1蛋白在結(jié)腸黏膜的正常組織中沒有表達，而在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于正常組織及癌旁組織。這些均提示Idl蛋白在腫瘤新生血管形成中可能起重要作用。在4個已發(fā)現(xiàn)的Id分子中，Id1在腫瘤中的異常表達更為普遍。但Id1蛋白與其他蛋白相互作用機制及調(diào)控Id1基因表達上游因子和Id1蛋白的下游效應因子還不清楚。

本研究顯示，上調(diào)Id1表達后，結(jié)腸癌HT－29細胞VEGF mRNA及蛋白均顯著提高，這種提高出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，同時腫瘤細胞增殖明顯加快；下調(diào)Id1表達后HT－29細胞VEGF mRNA及蛋白均顯著降低，也出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，而腫瘤細胞增殖明顯減慢。以上結(jié)果證實了在結(jié)腸癌HT－29細胞中Id1通過下游因子VEGF來產(chǎn)生新生血管網(wǎng)，從而影響腫瘤細胞的增殖。

本研究證實，在結(jié)腸癌HT－29細胞中Id1為VEGF的上游因子，其在結(jié)腸癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用，Id1有望成為結(jié)腸癌治療的一個新靶點［15］。但Id1通過何種信號途徑來調(diào)控VEGF，以及調(diào)控Id1基因的上游因子有待今后實驗中進一步明確。

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