周 進(jìn)，方 麗，姚文秀，熊竹娟，周 詳，周 行，謝 華

（1.四川省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，成都 610041；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610500）

惡性腫瘤是目前的醫(yī)學(xué)難點(diǎn)。傳統(tǒng)的治療手段包括手術(shù)、放療、化療以及最近新興的生物靶向治療。然而，對(duì)于化學(xué)治療來說，盡管藥物眾多，但強(qiáng)烈的不良反應(yīng)限制了許多聯(lián)合方案的運(yùn)用，迫切需要尋找高效低毒的抗腫瘤新型藥物。近年來，天然植物提取物——小分子黃酮類受到研究者們的強(qiáng)烈關(guān)注。黃酮類主要包括了姜黃素、槲皮素和厚樸等。他們存在廣泛，體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明其能抑制子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、肺癌、白血病等多種惡性細(xì)胞生長［1－4］。本課題研究擬通過生長抑制試驗(yàn)及劃痕檢測，觀察槲皮素對(duì)人肝癌細(xì)胞（human hepatocellular carcinoma cell lines，HepG2）生物學(xué)行為的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 槲皮素100mg（批號(hào)：051K1225）購自Sigma公司。使用時(shí)經(jīng)二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，Dulbecco最低必需培養(yǎng)基（Eagle′s minimum essential medium，DMEM）培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，其中DMSO終濃度小于0.1%。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胰蛋白酶（Tyrisin）購自Promega公司，HepG2細(xì)胞由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室留存。

1.2 HepG2細(xì)胞生長形態(tài)學(xué)觀察 復(fù)蘇凍存的HepG2細(xì)胞，于5%CO2、37%濕度的孵箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡（Olympus）對(duì)槲皮素作用前、后HepG2細(xì)胞的生長速度、形態(tài)、懸浮細(xì)胞比例進(jìn)行比較、評(píng)估。

1.3 生存抑制實(shí)驗(yàn)［3－（4，5－dimethyl－2－thiazolyl）－2，5－diphenyl－2H－tetrazolium bromide，MTT］ HepG2細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，胰蛋白酶消化，以104個(gè)／每孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積約200μL。繼續(xù)培養(yǎng)24h，依次加入濃度為10、20、50、100和200μmol／L的槲皮素稀釋液，以含0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基為空白對(duì)照，分別培養(yǎng)24、48和72h。加入MTT液（5mg／mL）20μL，孵育4h，加入100μL DMSO，振蕩10min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀（490nm）測定各孔的光吸收值（A），按公式：生存抑制率＝1－藥物組A／空白對(duì)照組A×100%進(jìn)行計(jì)算。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)皿，接種密度為1×105／孔。待細(xì)胞生長至約80%培養(yǎng)皿時(shí)，用200μL移液槍尖在細(xì)胞中做一劃痕，寬度約2mm。磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗培養(yǎng)皿以移去上層懸浮細(xì)胞。加入50μM濃度的槲皮素稀釋液，以正常DMEM培養(yǎng)基為空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)，使用數(shù)碼照相系統(tǒng)（Carl Zeiss，Axiovert200，SIP No.MICO1223，德國）于實(shí)驗(yàn)后24、48h對(duì)同一劃點(diǎn)照相，重復(fù)3次，并將圖片數(shù)據(jù)輸入Scion軟件，計(jì)算劃痕空白剩余面積，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1.5 Western blot檢測 槲皮素作用前、后HepG2細(xì)胞中細(xì)胞 遷 移 黏 附 因 子 （Ras GTPase－activating－like protein，IQGAP1）的表達(dá)差異：細(xì)胞裂解液裂解HepG2細(xì)胞，提取總蛋白，定量。電泳分離、轉(zhuǎn)膜。50g／L脫脂奶粉緩沖液4℃封閉過夜，加一抗IQGAP1（1∶200）室溫振搖孵育2h，洗膜30 min后加二抗（1∶8 000）室溫振搖孵育1h，洗膜，暗盒顯影。內(nèi)參選用β－actin。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，將MTT檢測數(shù)據(jù)和劃痕修復(fù)面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素處理細(xì)胞后形態(tài)學(xué)變化 正常HepG2細(xì)胞生長旺盛，緊貼培養(yǎng)瓶壁生長，輪廓清楚，胞漿飽滿，細(xì)胞間接觸緊密。經(jīng)槲皮素處理后，細(xì)胞變圓，增殖變慢，附壁疏松，脫壁，周圍碎片增多。隨著槲皮素作用時(shí)間和濃度的增加，上述變化愈加明顯。

圖1 不同濃度槲皮素對(duì)HepG2細(xì)胞生存抑制效果

圖2 HepG2細(xì)胞下的表達(dá)（倒置顯微鏡，×10）

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)空白面積比較

2.2 槲皮素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 MTT顯示，槲皮素對(duì)HepG2細(xì)胞生長有明顯抑制作用，且具有劑量和時(shí)間依賴性。藥物處理24h后，槲斗皮素濃度為10、20、50、100和200 μmol／L的抑制率分別為8%、18%、22%、27%、27%；藥物繼續(xù)作用至48h，50μmol／L濃度的抑制作用明顯提高，達(dá)到51%（IC50），細(xì)胞生存抑制作用比較見圖1。

2.3 加入槲皮素前、后HepG2遷徙能力的變化 正常生長的HepG2細(xì)胞生長旺盛，遷徙能力強(qiáng)，24h劃痕面積明顯減小，48hHepG2細(xì)胞幾乎全部覆蓋劃痕。而在加入50μmol／L槲皮素作用48h后，HepG2細(xì)胞的遷徙能力明顯減弱（圖2）。對(duì)殘留劃痕面積進(jìn)行比較，兩組差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3），P＜0.05。

2.4 槲皮素作用前、后HepG2細(xì)胞中IQGAP1蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)48h獲取Western blot結(jié)果（圖4）相對(duì)于正常生長的HepG2細(xì)胞來說，加入槲皮素（50μmol／L）充分作用后，細(xì)胞中IQGAP1蛋白表達(dá)明顯減低。

圖4 Western blot檢測槲皮素作用前、后HepG2細(xì)胞中IQGAP1蛋白的表達(dá)

3 討 論

槲皮素在惡性腫瘤、炎癥反應(yīng)的作用是目前生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要觀察槲皮素在HepG2細(xì)胞生長增殖和轉(zhuǎn)移遷徙中的抑制作用。結(jié)果顯示，槲皮素能明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖生長，并對(duì)其遷徙能力產(chǎn)生強(qiáng)大的負(fù)調(diào)控作用。

關(guān)于槲皮素發(fā)揮抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制，目前的研究表明可能與下列因素有關(guān)：（1）失活原癌基因akt－1、bcr、ras，上調(diào)抑癌基因p21、p53等表達(dá)［5］；（2）抑制腫瘤新生血管生成：VEGF是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，而槲皮素則可以高效抑制VEGF表達(dá)［6］；（3）誘導(dǎo)凋亡：槲皮素能上調(diào) Bax、Bad、Bcl－x等促凋亡基因，抑制凋亡負(fù)調(diào)控分子Bcl－2而誘導(dǎo)凋亡［7］；（4）阻遏熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）產(chǎn)物，HSP是重要的分子伴侶蛋白，能減輕高熱、低氧、化學(xué)藥物等刺激對(duì)細(xì)胞的損傷。槲皮素能下調(diào) HSP70、HSP72、HSP90基因轉(zhuǎn)錄水平［8］；（5）抗氧化作用：槲皮素還能減弱細(xì)胞的氧化壓力損傷［9］；（6）其他如逆轉(zhuǎn)多藥耐藥（MDR）機(jī)制［10］。

最近，IQGAP1在惡性細(xì)胞黏附遷移中的中樞作用受到研究者的廣泛關(guān)注。IQGAPs（Ras GTPase－activating－like protein）是真核細(xì)胞內(nèi)一個(gè)相對(duì)保守的蛋白家族，位于染色體15q26，具有IQ和Ras－GTPase激活蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域（Ras－GAP－related domain，GRD）。IQ結(jié)構(gòu)域由4個(gè)串聯(lián)排列的IQ模體組成，能與鈣調(diào)蛋白、肌球蛋白輕鏈和S100B結(jié)合［11］。GRD結(jié)構(gòu)域可以和 Rho GTPase、cdc42、Racl結(jié)合［12］。目前，人類至少發(fā)現(xiàn)了3個(gè)家族成員，IQGAPl、IQGAP2和IQGAP3。IQGAPl是研究熱點(diǎn)，許多學(xué)者認(rèn)為由IQGAP1介導(dǎo)的細(xì)胞黏附遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的基本步驟之一［13］。這個(gè)生命過程中，在上游蛋白R(shí)ac1、GTP等信號(hào)調(diào)節(jié)下，IQGAP1通過與α－連環(huán)蛋白（α－catenin）、β－連環(huán)蛋白（β－catenin）、鈣調(diào)蛋白相互作用改變細(xì)胞之間的黏附能力［14］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在抑制IQGAP1功能后，惡性細(xì)胞的黏附遷移能力顯著降低，與正常時(shí)比較表現(xiàn)為較低的侵襲力［15］。

本研究觀察到槲皮素作用前、后HepG2細(xì)胞生長及遷移能力的變化，并結(jié)合免疫印跡法中IQGAP1表達(dá)結(jié)果，推測槲皮素對(duì)IQGAP1基因的影響可能是其干擾HepG2細(xì)胞生長、減弱其黏附侵襲能力的途徑之一。

［1］ 周進(jìn)，方麗，姚文秀，等.細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記——質(zhì)譜技術(shù)測定槲皮素對(duì)人肝癌細(xì)胞熱休克蛋白表達(dá)的影響［J］.中華腫瘤雜志，2011，33（10）：737－741.

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