李 匯，毛用敏，趙莉莉，崔讓莊，王佩顯

（1.天津醫(yī)科大學(xué) 300070；2.天津市胸科醫(yī)院 300051）

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分的主要酶系［1］，金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）是MMPs的內(nèi)源性特異性抑制劑［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，MMPs／TIMPs的比例失衡與動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后再狹窄以及心臟重塑等病理過程密切相關(guān)［3］。以腺病毒（adenovirus，AdV）為載體介導(dǎo)TIMP1到靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)ECM的生成和降解，從而調(diào)節(jié)粥樣斑塊的穩(wěn)定性可能成為冠心病基因治療的新方法［4］。本研究構(gòu)建攜帶人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑因子1（human tissue inhibitor of matrix melall oprolease－1，hTIMP1）基因片段的重組腺病毒 Ad－h(huán)TIMP1［5］，并成功感染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CRL－1730，從而為進(jìn)一步的在體實(shí)驗(yàn)提供平臺(tái)，為基因治療動(dòng)脈粥樣硬化，穩(wěn)定粥樣斑塊提供靶基因的線索。

1 材料與方法

1.1 材料 AdEasy復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)（穿梭質(zhì)粒pAd－Track－CMV和骨架質(zhì)粒pAdEasy－1）以及包裝細(xì)胞系人胚腎細(xì)胞（human embryonic kidney 293T，HEK293T）購自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)室；pUCm－T載體質(zhì)粒，BJ 5183菌株、JM109菌株和DH5α菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。TaqDNA聚合酶為本實(shí)驗(yàn)室提取保存，限制性內(nèi)切酶BglⅡ、NotⅠ和DNA marker購自TakaRa生物工程（大連）有限公司，PacI購自NEB公司；T4 DNA連接酶、高純度質(zhì)粒柱式提取試劑盒和脂質(zhì)體購自Invitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和 DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；PCR引物由上海生工公司合成。DNA測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物工程公司完成。

1.2 腺病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 pUC－h(huán)TIMP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 Genebank中搜索人TIMP1序列，設(shè)計(jì)上游引物為：5′－AGA ACC CAC CAT GGC CCC CT－3′；下游引物為：5′－GAT TCA GGC TAT CTG GGA CCG－3′。從人心肌細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription－PCR，RT－PCR）得到人 TIMP1的基因片段，連接到pUCm－T載體質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)JM109細(xì)胞，NcoI酶切鑒定正確后行二次轉(zhuǎn)化入JM109進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序正確后提質(zhì)粒pUC－h(huán)TIMP1。

1.2.2 穿梭質(zhì)粒 pAdTrack－CMV－h(huán)TIMP1的構(gòu)建 分別用BglⅡ和NotⅠ雙酶切pUC－h(huán)TIMP1和穿梭質(zhì)粒pAdTrack－CMV并凝膠回收hTIMP1片段和開環(huán)質(zhì)粒pAdTrack－CMV，連接后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定正確后二次轉(zhuǎn)化JM109擴(kuò)增，PmeⅠ酶切使之線性化，命名為重組質(zhì)粒pAdTrack－CMV－h(huán)TIMP1。

1.2.3 同 源 重 組 構(gòu) 建 重 組 腺 病 毒 質(zhì) 粒 pAdEasy－GFP－h(huán)TIMP1 電穿孔法（2 500V，5ms）將PemⅠ酶切線性化的pAdTrack－CMV－h(huán)TIMP1重組質(zhì)粒和 pAdTrack－CMV（空載體陰性對(duì)照）分別轉(zhuǎn)化到含有pAdEasy－1的電感受態(tài)BJ5183中，篩選后BamHI和PacⅠ酶切鑒定。選取重組正確的質(zhì)粒（pAd－h(huán)TIMP1和pAd－Track）在DH5α菌中大量擴(kuò)增，高純度質(zhì)粒柱式提取試劑盒提取質(zhì)粒，PacⅠ酶切線性化后凝膠回收較大片段。

1.3 重組腺病毒在293T細(xì)胞中包裝和擴(kuò)增

1.3.1 陽離子脂質(zhì)體法將重組腺病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝 轉(zhuǎn)染前1d，將2個(gè)60mm培養(yǎng)皿中HEK293T細(xì)胞調(diào)整為0.6×106個(gè)細(xì)胞／皿，轉(zhuǎn)染當(dāng)天應(yīng)用脂質(zhì)體lipofectamine 2000及Plus reagent將pAd－h(huán)TIMP1和pAd－Track轉(zhuǎn)染到兩皿中，24h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathogenic effect，CPE）。于轉(zhuǎn)染后第9天收集細(xì)胞，反復(fù)凍融法得到重組腺病毒Ad－h(huán)TIMP1和Ad－Track上清液。

1.3.2 包裝好的重組腺病毒感染293T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增 取病毒上清液的1／3感染293T細(xì)胞，感染后第3天反復(fù)凍融法收集重組腺病毒上清液，反復(fù)感染4次于293T細(xì)胞中擴(kuò)增病毒到所需滴度。

1.3.3 重組腺病毒的純化和觀察 CsCl密度梯度離心法純化重組腺病毒顆粒，采用OD260法測(cè)定腺病毒的滴度。并用透射電鏡觀察腺病毒形態(tài)。

1.4 腺病毒介導(dǎo)TIMP1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

1.4.1 分組 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CRL－1730，將之分到6孔板中（2.4×105細(xì)胞／孔）。分為空白對(duì)照組、Track對(duì)照組和TIMP1實(shí)驗(yàn)組，每組4個(gè)復(fù)孔。Ad－Track感染Track對(duì)照組，Ad－h(huán)TIMP1感染TIMP1實(shí)驗(yàn)組。48h后觀察并收集細(xì)胞。

1.4.2 RT－PCR法擴(kuò)增細(xì)胞TIMP1基因片段，以GAPDH為內(nèi)參照 采用UNIQ－10柱總RNA抽提試劑盒提取各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CRL－1730中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴(kuò)增TIMP1基因片段。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。以電泳條帶的灰度代表mRNA含量，目的基因與內(nèi)參電泳條帶灰度比值反應(yīng)目的基因的相對(duì)值。采用Gelpro3.1凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pAdEasy－GFP－h(huán)TIMP1重組質(zhì)粒 PacⅠ酶切鑒定 RTPCR法從人心肌細(xì)胞中擴(kuò)增hTIMP1，可以得到637bp的特異帶。在pAd－Track－CMV上有2個(gè)PacⅠ的酶切位點(diǎn)，將重組子切為一個(gè)大片段和一個(gè)約4.5kb的小片段（圖1）。

圖1 PacⅠ 酶切pAd－h(huán)TIMP1和pAd－Track重組質(zhì)粒

圖2 轉(zhuǎn)染Ad－h(huán)TIMP1重組腺病毒

2.2 293T細(xì)胞中包裝并擴(kuò)增腺病毒 重組腺病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，第4～5天熒光顯微鏡下可觀察到GFP呈“彗星狀”改變，感染293T細(xì)胞后第3天可以觀察到典型的CPE（圖2），純化后OD260法測(cè)得重組腺病毒 Ad－h(huán)TIMP1的滴度為1.9×1012v.p／mL，對(duì)照重組腺病毒pAd－Track的滴度為0.6×1012v.p／mL。透射電鏡下見病毒顆粒直徑約90nm，呈多面體形狀，絕大多數(shù)病毒顆粒完整（圖3）。腺病毒裂解液TIMP1 PCR，2%瓊脂糖凝膠電泳圖（圖4）。TIMP1實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮細(xì)胞TIMP1mRNA的表達(dá)（1.062±0.083）明顯高于空白對(duì)照組（0.449±0.128）和Track對(duì)照組（0.365±0.164），P＜0.05，見圖5。重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CRL－1730（圖6）。

圖3 Ad－h(huán)TIMP1病毒顆粒透射電鏡圖

圖4 腺病毒裂解液TIMP1PCR擴(kuò)增片段（可見637bp的特異條帶）

圖5 3組TIMP1 2%瓊脂糖凝膠水平電泳圖

圖6 重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CRL－1730熒光表達(dá)情況（倒置熒光顯微鏡）

3 討 論

MMPs是一類以Zn2＋為輔助因子的蛋白水解酶家族，在體內(nèi)主要降解ECM。既往研究表明，AS斑塊損傷部位MMPs表達(dá)升高，包括屬于間質(zhì)膠原酶的 MMP1、屬于明膠酶的MMP2和MMP9，以及屬于基質(zhì)降解酶的 MMP3，而TIMP1和 TIMP2等表達(dá)減少［6－7］。Galis等［8］在冠狀 AS中檢測(cè)到MMPs與TIMPs的比例失調(diào)，認(rèn)為調(diào)節(jié)兩者之間的比例可起到治療AS的作用。

Rouis等［9］報(bào)道腺病毒介導(dǎo)TIMP1過表達(dá)可以減輕ApoE－／－小鼠的頸動(dòng)脈粥樣硬化損傷程度，并推測(cè)此作用是由于TIMP1抑制MMPs活性保護(hù)了細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而抑制了平滑肌細(xì)胞的移行所致。該研究中，小鼠喂食6周高膽固醇飲食后注射攜帶TIMP1的重組腺病毒，4周后加以評(píng)估。發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的損傷面積明顯減小。這與之前研究小鼠轉(zhuǎn)基因過表達(dá)人TIMP1抑制 MMPs表達(dá)的結(jié)果相一致［10－11］。另外，轉(zhuǎn)染攜帶TIMP1的重組腺病毒（Ad.TIMP1）使豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)TIMP1，可以減少細(xì)胞移行及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲［12］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，利用分子生物學(xué)技術(shù)使局部TIMP1過表達(dá)，為人們治療AS帶來希望［13］。

本研究采用He等［5］于1998年建立的技術(shù)方案，成功地進(jìn)行了攜帶人TIMP1的重組腺病毒的構(gòu)建，并采用Zeng等［14］報(bào)道的兩步轉(zhuǎn)化法，即將pAdEsay－1質(zhì)粒先轉(zhuǎn)化入BJ5183大腸埃希菌，并制備其電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，再利用電轉(zhuǎn)化儀將pAd－Track－CMV轉(zhuǎn)入該菌，進(jìn)而與細(xì)胞內(nèi)的pAdEsay－1進(jìn)行同源重組。這種方法與一步轉(zhuǎn)化法相比，可以大大提高同源重組的效率，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，重組Ad－h(huán)TIMP1可以成功感染內(nèi)皮細(xì)胞使實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)TIMP1過表達(dá)。為TIMP1作為靶基因用于穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊的基因治療奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Watanabe N，Ikeda U.Matrix metalloproteinases and atherosclerosis［J］.Curr Atheroscler Rep，2004，6（2）：112－120.

［2］ Reis ST，Pontes－Junior J，Antunes AA，et al.MMP－9overexpression due to TIMP－1and RECK under－expression is associated with prognosis in prostate cancer［J］.Int J Biol Markers，2011，26（4）：255－261.

［3］ Liu P，Sun M，Sader S.Matrix metalloproteinases in cardiovascular disease［J］.Can J Cardiol，2006，22（Suppl B）：25B－30B.

［4］ Gaffney MM，Hynes SO，Barry F，et al.Cardiovascular gene therapy：current status and therapeutic potential［J］.Br J Pharmacol，2007，152（2）：175－188.

［5］ He TC，Zhou S，Costada LT，et al.A simplified system for generation recombinant adenoviruses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（5）：2509－2514.

［6］ W?gs?ter D，Zhu C，Bj?rkegren J，et al.MMP－2and MMP－9are prominent matrix metalloproteinases during atherosclerosis development in the Ldlr（－／－）Apob（100／100）mouse［J］.Int J Mol Med，2011，28（2）：247－253.

［7］ Heo SH，Cho CH，Kim HO，et al.Plaque rupture is a determinant of vascular events in carotid artery atherosclerotic disease：involvement of matrix metalloproteinases 2 and 9［J］.J Clin Neurol，2011，7（2）：69－76.

［8］ Galis ZS，Sukhova GK，Lark MW.Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques［J］.J Clin Invest，1994，94（6）：2493－2503.

［9］ Rouis M，Adamy C，Duverger N，et al.Adenovirus－mediated overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinase－1reduces atherosclerotic lesions in apolipo protein E－deficient mice［J］.Circulation，1999，100（5）：533－540.

［10］Watanabe M，Yakahashi Y，Ohta T，et al.Inhibition of metastasis in human gastric cancer cells transfected with tissue inhibitor of metalloproteinase－1gene in nude mice［J］.Cancer，1996，77（8Suppl）：1676－1680.

［11］Alexander CM，Howard EW，Bissel M，et al.Rescue of mammary epithelial cell apoptosis and entactin degradation by a tissue inhibitor of metalloproteinases－1transgene［J］.J Cell Biol，1996，135（6）：1669－1677.

［12］Fernandez HA，Kallenbach K，Seghezzi G，et al.Inhibition of endothelial cell migration by gene transfer of tissue inhibitor of metalloproteinases－1［J］.J Surg Res，1999，82（2）：156－162.

［13］Beaudeux JL，Giral P，Bruckert E，et al.Matrix metalloproteinases and atherosclerosis.Therapeutic aspects［J］.Ann Biol Clin，2003，61（2）：147－158.

［14］Zeng M，Smith SK，Siegel F，et al.AdEasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid preceding homologous recombination［J］.Biorechniques，2001，31（2）：260－262.

［15］尹冰楠，李冬田，李秋香.一種簡易、廉價(jià)、高效構(gòu)建重組腺病毒載體的方法［J］.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，11（2）：171－174.