李瑾昱，張國慶，焦順昌，溫新宇，孫勝杰

西妥昔單抗(cetuximab，IMC-C225)是一種抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的人/鼠嵌合型IgG1單克隆抗體，能夠以高出內(nèi)源配體5～10倍的親和力與EGFR特異結(jié)合，阻礙其與內(nèi)源性配體的結(jié)合，進(jìn)而阻斷受體的二聚化﹑酪氨酸激酶磷酸化及下游一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻斷受體功能。K-ras是EGFR信號通路下游的小分子G蛋白，K-ras基因點(diǎn)突變可導(dǎo)致該信號通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，不受EGFR上游信號指令的影響[1-2]。研究表明，西妥昔單抗對K-ras基因野生型結(jié)直腸癌患者的治療效果好于突變型[3-4]，然而在非小細(xì)胞肺癌患者中進(jìn)行的研究表明，雖然與單純化療相比，聯(lián)合西妥昔單抗能延長患者的總生存期[5-6]，但治療獲益與K-ras基因突變狀態(tài)無關(guān)[5-10]。因此推測西妥昔單抗對K-ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌可能存在其他作用機(jī)制。本研究以文獻(xiàn)報道的K-ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞作為靶細(xì)胞[11-12]，觀察西妥昔單抗對該細(xì)胞的效應(yīng)及基因表達(dá)譜的變化，探討西妥昔單抗對非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 HERA Safe KS-12型生物安全柜﹑HERA Cell 240型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱﹑SORVALL LEGEND MACH 1.6R離心機(jī)﹑Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)；Olympus BX41正置顯微鏡﹑Olympus CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；流式細(xì)胞儀(Beckman公司，美國)；Veriti 96孔梯度PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)。西妥昔單抗注射液(默克公司，德國)；RPMI 1640培養(yǎng)基﹑無菌PBS﹑胎牛血清(Gibco公司，美國)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Amresco公司，美國)；Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories公司，日本)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；Blood & Cell Culture DNA Mini Kit(Qiagen公司，德國)；2×Taq PCR MasterMix Kit(北京博邁德科技有限公司)；Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國)；RNA Clean-up試劑盒(MACHEREY-NAGEL公司，德國)；RT-PCR試劑盒(北京晶美生物有限公司)；人腫瘤相關(guān)基因芯片﹑cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒(北京博奧生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶細(xì)胞制備 人肺腺癌A549細(xì)胞由本室常規(guī)凍存并復(fù)蘇，細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清﹑100U/ml青霉素﹑100U/ml鏈霉素)于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞制成懸液，加20g/L臺盼藍(lán)染液混勻，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞。

1.2.2 西妥昔單抗對A549細(xì)胞生長的抑制作用將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個細(xì)胞(100μl)，37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱孵育12h，待其完全貼壁后，實驗組加入西妥昔單抗(終濃度0.045mg/ml)，對照組加入等體積生理鹽水，兩組均設(shè)3個復(fù)孔。于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱分別孵育24﹑48h后，每孔加入CCK-8試劑10μl，2h后用酶標(biāo)儀于450nm處測定吸光度(A)值，結(jié)果取均值，重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔5×105個細(xì)胞(2ml)，37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱孵育12h，待其完全貼壁后，實驗組加入西妥昔單抗(終濃度0.045mg/ml)，對照組加入等體積生理鹽水。于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱分別孵育24﹑48h后將兩組細(xì)胞用胰酶消化，PBS洗滌2次，1500r/min離心5min，棄上清。加入500μl Binding Buffer混懸細(xì)胞，再加入5μl Annexin V-FITC混勻，最后加入5μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)15min，流式細(xì)胞儀檢測，分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 基因芯片制備與檢測 ①將對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×105個細(xì)胞(2ml)，37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱孵育12h，待其完全貼壁后，實驗組加入西妥昔單抗(終濃度0.045mg/ml)，對照組加入等體積生理鹽水。于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h后抽提細(xì)胞總RNA并檢測純度。②對樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記。③雜交﹑清洗與芯片掃描：RNA標(biāo)記后溶于80μl雜交液(3×SSC﹑0.2%SDS﹑5×Denhart's﹑25%甲酰胺)中42℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42℃含0.2%SDS，2×SSC的液體中洗5min，然后在0.2×SSC中室溫洗5min。玻片甩干后用Luxscan 10KA雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描。采用Luxscan 3.0圖像分析軟件對芯片圖像進(jìn)行分析并篩選差異表達(dá)基因，以灰度值比值相差2倍以上作為差異具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。采用SAM軟件進(jìn)行分析，錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)控制在5%以內(nèi)。

1.2.5 Real-time PCR檢測 ①DNA酶消化基因組DNA；②總RNA純化；③1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA消化效果；④將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；⑤Real-time PCR反應(yīng)；⑥數(shù)據(jù)處理：利用儀器所配軟件計算各張PCR芯片中每個基因?qū)崟r熒光強(qiáng)度顯著大于背景值時的循環(huán)數(shù)值，采用2-ΔΔCt方法比較相應(yīng)基因表達(dá)量的變化。

圖1 西妥昔單抗對A549細(xì)胞的生長抑制作用(n=3)Fig. 1 Effect of cetuximab on proliferation inhibition of A549 cells (n=3)

2 結(jié) 果

2.1 西妥昔單抗對A549細(xì)胞的生長抑制作用CCK-8法檢測結(jié)果顯示，將西妥昔單抗分別作用于A549細(xì)胞24﹑48h，間接反映活細(xì)胞數(shù)目的A值低于照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義意義(P＜0.05，圖1)，表明西妥昔單抗對A549細(xì)胞的生長具有抑制作用。

2.2 西妥昔單抗對A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用西妥昔單抗作用24h后，K-ras基因突變的A549細(xì)胞凋亡率為12.43%±2.08%，而作用48h后凋亡率為23.20%±1.78%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且兩個時間點(diǎn)比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。

圖2 西妥昔單抗對A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用Fig.2 Derivation eff ect of cetuximab on apoptosis of A549 cells

2.3 基因芯片掃描結(jié)果 與對照組相比，實驗組細(xì)胞中有10個基因表達(dá)顯著上調(diào)，9個基因表達(dá)顯著下調(diào)(表1﹑2)。此外，一些具有重要功能的基因表達(dá)變化雖然未達(dá)到2倍以上，但也有顯著改變，如胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP3)基因表達(dá)上調(diào)1.96倍，p27KIP1基因表達(dá)上調(diào)1.89倍。

2.4 Real-time PCR檢測結(jié)果 STAT1基因參與細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過程，因此選取STAT1基因?qū)π酒Y(jié)果進(jìn)行驗證。此外，基因芯片結(jié)果顯示，IGFBP3基因表達(dá)上調(diào)1.96倍，由于其具有重要抑癌作用，因此，本研究也利用Real-time PCR對其表達(dá)水平進(jìn)行驗證。以GAPDH作為內(nèi)參，以各基因的差異比除以內(nèi)參值，對各基因的差異比進(jìn)行歸一化。結(jié)果顯示STAT1和IGFBP3基因歸一化后的差異比分別為1.5和1.74，基因芯片得到的差異比為2.07和1.96。兩種檢測結(jié)果都表明STAT1和IGFBP3基因表達(dá)上調(diào)。

表1 西妥昔單抗作用后A549細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因Tab.1 Upregulated genes of A549 by cetuximab

表2 西妥昔單抗作用后A549細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因Tab.2 Downregulated genes of A549 by cetuximab

3 討 論

西妥昔單抗是一種抗EGFR的人/鼠嵌合型IgG1單克隆抗體，可顯著延長晚期非小細(xì)胞肺癌患者的中位生存期﹑1年生存率及總生存期[6-7]。2009年西妥昔單抗被納入NCCN指南并推薦作為晚期非小細(xì)胞肺癌患者的一線治療藥物。西妥昔單抗對K-ras基因野生型結(jié)直腸癌的治療效果優(yōu)于突變型[3-4,11]，而對非小細(xì)胞肺癌的療效與K-ras基因突變狀態(tài)無關(guān)[9]，表明其對K-ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌同樣具有抗腫瘤作用。本研究從細(xì)胞水平探討西妥昔單抗對非小細(xì)胞肺癌的抗腫瘤作用及其機(jī)制。

本研究首先將西妥昔單抗作用于A549細(xì)胞24h及48h，采用CCK-8法檢測藥物對細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示，與對照組相比，西妥昔單抗對A549細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用，即對K-ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌具有體外抗腫瘤作用。既往研究表明，K-ras基因突變的腫瘤細(xì)胞無需EGFR配體與受體的結(jié)合就能使EGFR通路自身磷酸化，從而激活下游信號通路，引起腫瘤細(xì)胞增殖。因此理論上即使西妥昔單抗阻斷了EGFR與配體的結(jié)合，也仍然不能阻止K-ras基因突變細(xì)胞EGFR信號通路的活化，不能發(fā)揮抗腫瘤作用。然而無論臨床試驗還是細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果均表明西妥昔單抗對K-ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌具有抗腫瘤作用，因此西妥昔單抗可能還存在其他抗腫瘤機(jī)制。

本研究檢測了西妥昔單抗作用24及48h后A549細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果表明西妥昔單抗能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，這可能是其對非小細(xì)胞肺癌發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一?；蛐酒瑱z測顯示，與對照組比較，西妥昔單抗作用48h后A549細(xì)胞中有19個基因表達(dá)差異在2倍以上，其中10個基因表達(dá)顯著上調(diào)，9個基因表達(dá)顯著下調(diào)。這些差異表達(dá)的基因涉及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的很多方面，如細(xì)胞增殖﹑細(xì)胞周期﹑細(xì)胞耐藥等，其中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的STAT1基因[12]表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步采用Realtime PCR對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗證也證實了這一點(diǎn)。STAT1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要環(huán)節(jié)可能是胞質(zhì)中STAT1激活并形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，或者STAT1直接上調(diào)細(xì)胞質(zhì)中Caspase-3﹑7的表達(dá)水平，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，STAT1激活后還可通過上調(diào)p27KIP1的表達(dá)使細(xì)胞停滯在G1期[13-14]。本研究的基因芯片結(jié)果也證實了西妥昔單抗作用后A549細(xì)胞的p27KIP1基因表達(dá)上調(diào)1.89倍。因此，西妥昔單抗作用后可能通過上調(diào)STAT1表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯從而對K-ras基因突變的A549細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。

此外，基因芯片結(jié)果顯示IGFBP3基因表達(dá)水平上調(diào)1.96倍，Real-time PCR驗證也顯示其表達(dá)上調(diào)。IGFBP3可通過IGF依賴性和非依賴性兩種方式抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)制﹑生長﹑增殖和轉(zhuǎn)移。一方面IGFBP3通過競爭抑制IGF-1與其受體結(jié)合，可部分阻斷IGF-1的促腫瘤細(xì)胞有絲分裂及凋亡抑制效應(yīng)[15]，另一方面IGFBP3可通過移位至細(xì)胞核而直接或間接地與核內(nèi)生長抑制基因和凋亡基因發(fā)生相互作用，從而影響細(xì)胞的基因表達(dá)，具有促凋亡作用[16-17]。此外，IGFBP3還能有效地阻止尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)刺激的侵襲途徑，最終抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[18]。IGFBP3作為最主要的IGFs結(jié)合蛋白，其表達(dá)水平升高可對肺癌的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生明顯的抑制作用。皮佳俐等[19]的研究提示IGFBP3對體外培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞株A549及肺鱗癌細(xì)胞株NCL-H520具有明顯的增殖抑制作用且呈一定的劑量依賴性。因此，上調(diào)IGFBP3表達(dá)也可能是西妥昔單抗對K-ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌發(fā)揮抑制作用的機(jī)制之一。

本研究在體外細(xì)胞水平證實了西妥昔單抗對K-ras基因突變的肺腺癌A549細(xì)胞具有生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，與臨床研究中西妥昔單抗對K-ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌有效的結(jié)果一致。此外，西妥昔單抗作用后A549細(xì)胞發(fā)生了一系列涉及細(xì)胞增殖﹑細(xì)胞周期﹑細(xì)胞耐藥等方面的基因表達(dá)改變，這些有可能與其作用機(jī)制相關(guān)，但仍有待進(jìn)一步研究探討。

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