徐小嫚，張 毅，曲 丹，張 萌，陳 愉，趙 立

長梗秦艽為龍膽科龍膽屬植物，分布于我國西藏東部至南部，主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肝膽疾病等。長梗秦艽酮(Waltonitone)是從長梗秦艽中分離得到的一個(gè)五環(huán)三萜類化合物。近年來，國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，長梗秦艽酮具有潛在的抗腫瘤作用，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［1-3］。但長梗秦艽酮對(duì)肺鱗癌NCI-H520細(xì)胞的作用尚不明確，本文就長梗秦艽酮對(duì)人肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H520細(xì)胞株的影響及機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 人肺鱗癌NCI-H520細(xì)胞由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);長梗秦艽酮:上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心;RPMI-1640培養(yǎng)基:美國Hyclone公司;胎牛血清:天津索萊寶生物工程有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT):南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;二甲基亞楓(DMSO):美國Sigma公司;0.25%胰蛋白酶:以色列Biological Industries公司;AnnexinV/PI雙染試劑盒:南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;2.5%戊二醛、1.0%餓酸:中國醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供;流式細(xì)胞儀:美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。肺鱗癌NCI-H520細(xì)胞呈單層貼壁生長，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2～3天傳代1次，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 消化收集NCI-H520細(xì)胞制成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，100 μL/孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)孔、空白對(duì)照孔及陰性對(duì)照孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。接種過夜細(xì)胞貼壁良好后加入終濃度為10、20、30、40 μmol/L 的長梗秦艽酮組，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前每孔加MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去上清，每孔加DMSO 150 μL振蕩混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長570 nm的每孔光密度值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。增殖抑制率按公式計(jì)算:抑制率=1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 消化收集NCI-H520細(xì)胞制成濃度為5×105的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入長梗秦艽酮(0、20、40 μmol/L)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，離心、洗滌細(xì)胞。AnnexinV-FITC、PI雙染細(xì)胞，避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 電鏡觀察NCI-H520細(xì)胞形態(tài)變化 NCIH520細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，加入終濃度為40 μmol/L的長梗秦艽酮溶液培養(yǎng)24 h，并設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后用錐形離心管離心棄上清，沉淀細(xì)胞先后應(yīng)用2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，逐級(jí)緩慢脫水，包埋，超薄切片，染色，透射電鏡觀察并照相。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，或兩組之間比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長梗秦艽酮對(duì)NCI-H520細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，長梗秦艽酮作用24 h后，隨著藥物濃度增大，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增加，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05)。見圖1。

圖1 長梗秦艽酮對(duì)NCI-H520細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，長梗秦艽酮作用24 h后，隨著藥物濃度的增大，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(見圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)長梗秦艽酮誘導(dǎo)NCI-H520細(xì)胞凋亡

2.3 電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化電子顯微鏡可觀察到長梗秦艽酮作用于NCI-H520細(xì)胞24 h后，細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了變化，可見染色質(zhì)濃聚、染色質(zhì)邊集等改變，出現(xiàn)了典型凋亡改變，而對(duì)照組無相應(yīng)變化(圖3)。

圖3 電子顯微鏡下觀察NCI-H520細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(4 000×)

3 討論

肺癌仍然是21世紀(jì)全世界惡性腫瘤患者死亡的首要原因。近20年來，化學(xué)治療等綜合治療應(yīng)用于臨床，但其對(duì)肺癌長期生存率的提高影響較?。?-5］。目前的治療是以鉑類為主的化療方案，由于化療的毒副反應(yīng)，很多患者難于依從，且一些較晚期的患者不能耐受化療［6］。而中藥及其有效成分以副作用小、不易耐藥等優(yōu)勢(shì)目前得到了腫瘤研究者和臨床醫(yī)生的青睞［7-8］。

長梗秦艽酮是從中藥中提取的天然化合物。本試驗(yàn)采用人肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H520細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果表明，長梗秦艽酮對(duì)NCI-H520細(xì)胞具有增殖抑制作用，并且呈時(shí)間劑量依賴關(guān)系。長梗秦艽酮可誘導(dǎo)NCI-H520細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞凋亡的形態(tài)，進(jìn)一步證實(shí)了長梗秦艽酮的抗腫瘤作用。細(xì)胞凋亡是腫瘤研究的熱點(diǎn)，許多臨床上常見的化療藥物包括中藥的抗腫瘤機(jī)制均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到控制腫瘤惡性生長的目的［9-10］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，長梗秦艽酮可以抑制肺鱗癌NCI-H520細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，為長梗秦艽酮在治療肺癌方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍需研究其抗腫瘤機(jī)制及臨床應(yīng)用，以進(jìn)一步評(píng)估其抗腫瘤效果。

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［1］Zhang Y，Zhang GB，Xu XM，et al.Suppression of growth of A549 lung cancer cells by waltonitone and its mechanisms of action［J］.Oncol Rep，2012，28(3):1029-1035.

［2］章漳，段朝輝，丁侃，等.長梗秦艽酮通過調(diào)節(jié)Akt和ERK1/2通路抑制人肝癌BEL-7402細(xì)胞生長［J］.中國中藥雜志，2009，34(24):3277-3280.

［3］Zhang Z，Wang S，Qiu H，et al.Waltonitone induces human hepatocellular carcinoma cells apoptosis in vitro and in vivo［J］.Cancer Lett，2009，286(2):223-231.

［4］王謙，宋勇.肺癌內(nèi)科治療研究新進(jìn)展［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2008，13(8):758-762.

［5］Parkin DM.Global cancer statistics in the year 2000［J］.Lancet Oncol，2001，2(9):533-543.

［6］Carney DN.Lung cancer time to move on from chemotherapy［J］.N Engl J Med，2002，34(2):126-128.

［7］Moghaddam SJ，Barta P，Mirabolfathinejad SG，et al.Curcumin inhibits COPD-like airway inflammation and lung cancer progression in mice［J］.Carcinogenesis，2009，30(11):1949-1956.

［8］Jafri SH，Glass J，Shi R，et al.Thymoquinone and cisplatin as a therapeutic combination in lung cancer:in vitro and in vivo［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29(1):87.

［9］Xavier CP，Lima CF，Preto A，et al.Luteolin，quercetin and ursolic acid are potent inhibitors of proliferation and inducers of apoptosis in both KRAS and BRAF mutated human colorectal cancer cells［J］.Cancer Lett，2009，281(2):162-170.

［10］Ren G，Zhao YP，Yang L，et al.Anti-proliferative effect of clitocine from the mushroom Leucopaxillus giganteus on human cervical cancer HeLa cells by inducing apoptosis［J］.Cancer Lett，2008，262(2):190-200.