班巧英，李建政，張立國，張玉鵬，Ajay Kumar Jha，艾斌凌

(1.哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.山西大學環(huán)境與資源學院，030006太原)

有機廢水厭氧生物處理過程是一個復雜的微生物學過程，需要在水解發(fā)酵菌群、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群和產(chǎn)甲烷菌群的協(xié)同作用下才能完成［1-2］.丙酸是廢水厭氧生物處理過程中重要的中間代謝產(chǎn)物之一，其厭氧氧化是一個高度吸能的生化反應，需要在丙酸氧化菌群和產(chǎn)甲烷菌群的協(xié)同作用下才能完成［1］.因此，當厭氧消化系統(tǒng)遇到如有機負荷提高、pH下降等沖擊時，丙酸很容易在厭氧生物處理系統(tǒng)中積累，導致厭氧生物處理系統(tǒng)運行效能和穩(wěn)定性下降，嚴重時將導致系統(tǒng)的“酸化”［3-4］.目前，關于導致厭氧生物處理系統(tǒng)中丙酸積累因素報道較多的是氫分壓和pH值［3-4］.也有研究者發(fā)現(xiàn)，當厭氧生物處理系統(tǒng)中丙酸質(zhì)量濃度超過一定臨界值后，系統(tǒng)內(nèi)會出現(xiàn)丙酸的大量積累，進而導致厭氧反應器的“酸化”［5］.為此，本文利用丙酸富集培養(yǎng)物，研究了不同丙酸質(zhì)量濃度條件下丙酸富集培養(yǎng)物的降解特性，并通過靜態(tài)搖瓶實驗研究不同丙酸質(zhì)量濃度對丙酸氧化菌和產(chǎn)甲烷菌代謝活性的影響，以期為闡明厭氧反應器中丙酸積累與反應器“酸化”之間的因果關系提供理論支持，為厭氧反應器運行提供參考.

1 實驗

1.1 種泥來源

接種污泥是取自本實驗室正在運行的處理制糖廢水的厭氧折流板反應器(ABR)第3格室厭氧顆粒污泥.ABR第3格室為典型的丙酸氧化功能格室，其進水丙酸平均質(zhì)量濃度為1 250 mg/L，出水丙酸平均質(zhì)量濃度為240 mg/L，丙酸去除率為81%，污泥的比丙酸降解率為0.51 g/(g·d).

1.2 富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)在150 mL的血清瓶中進行.液體培養(yǎng)基由丙酸(唯一碳源)加基礎培養(yǎng)基構成［6］，其中丙酸質(zhì)量濃度為1 000 mg/L.培養(yǎng)基初始pH控制在7.5.在氮氣保護下將種泥接種到培養(yǎng)基中，然后置于35℃、150 r/min的空氣浴恒溫搖床中進行富集培養(yǎng).當培養(yǎng)基中的丙酸去除率達95%以上時，將富集培養(yǎng)物轉入到新鮮培養(yǎng)基.如此反復進行傳代富集培養(yǎng).

1.3DNA提取和PCR-DGGE分析

采用DNA提取試劑盒(MO Bio Laboratories，Inc.，Carlsbad，CA，USA)提取厭氧活性污泥總DNA;PCR及DGGE分析參照文獻［7］進行.PCR所用引物分別為真細菌通用引物和古細菌通用引物，真細菌引物序列為:341F，5＇-CCTACGGGAGGCAGCAG-3＇，帶GC夾;907R，5＇-CCGTC AATTCMTTTGAGTTT-3＇.古細菌引物序列為:344F，5＇-ACGGGGYGCAGCAGGC GCGA-3＇，帶GC夾;915R，5＇-GTGCTCCCCCGCCAAT TCCT-3＇.測序結果與NCBI的BlastX進行序列比對，并挑選目標序列用MEGA 3.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 靜態(tài)搖瓶實驗

靜態(tài)搖瓶實驗采用間歇培養(yǎng)方式進行，實驗容器采用150 mL的血清瓶.液體培養(yǎng)基由丙酸(唯一碳源)加基礎培養(yǎng)基構成，其中丙酸質(zhì)量濃度共設有1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L 5個質(zhì)量濃度梯度.每個血清瓶中加入40 mL培養(yǎng)基，10 mL丙酸富集培養(yǎng)物(MLVSS為1.1 g/L)，培養(yǎng)基和接種物的體積比為4∶1.在35℃、150 r/min的空氣浴恒溫搖床中進行靜態(tài)搖瓶實驗.每個丙酸質(zhì)量濃度梯度做3個平行樣，數(shù)據(jù)分析取其平均值.每12 h測定一次產(chǎn)氣量、氣體組成，每24 h測定一次揮發(fā)酸組成及pH.

1.5 分析項目及方法

pH、生物量(以揮發(fā)性懸浮固體總量MLVSS計)采用國際標準方法測定［8］，發(fā)酵產(chǎn)氣量采用10～50 mL的玻璃注射器排氣計量，并折算為標準狀態(tài)體積(0℃，101.325 kPa).發(fā)酵氣組分和揮發(fā)酸組成分別采用山東魯南瑞虹化工儀器有限公司的SP-6800A型(TCD檢測器)和SP6890型(FID檢測器)氣相色譜測定.累計產(chǎn)甲烷量參照Owen法進行計算［9］.

2 結果與分析

2.1 富集培養(yǎng)物的菌群組成解析

丙酸是有機廢水厭氧生物處理過程中重要的中間代謝產(chǎn)物之一，復雜有機物轉化成甲烷時30%左右的甲烷來自丙酸的氧化［10］.因此，強化厭氧消化系統(tǒng)中丙酸氧化菌群的代謝活性對于提高厭氧反應器運行效能及穩(wěn)定性具有重要意義.本研究以丙酸為唯一碳源，經(jīng)過15代連續(xù)傳代富集培養(yǎng)后，得到一個中溫互營丙酸氧化菌群.

如圖1所示，富集之后的培養(yǎng)物以梭菌、桿菌和竹節(jié)狀絲狀菌為優(yōu)勢菌.為了進一步了解富集培養(yǎng)物中微生物的系統(tǒng)發(fā)育地位及其功能，采用PCR-DGGE指紋分析技術對富集前后微生物樣品進行了群落結構解析(圖2).從真細菌的DGGE圖譜(圖2(a))可以看出，富集培養(yǎng)后的微生物多樣性有所下降.隨著富集培養(yǎng)的進行，條帶B1和B2的信號顯著增強，表明這兩個條帶所代表的微生物被富集.條帶B1和B2分別與Syntrophobacter sulfatireducens和S．wolinii的相似性為97%和95%(圖3(a)).已有研究表明:在甲烷發(fā)酵系統(tǒng)中，S．sulfatireducens和S．wolinii可以與產(chǎn)甲烷菌構成產(chǎn)甲烷互營菌群，實現(xiàn)對丙酸的高效氧化［11-12］.這個結果暗示了條帶B1和B2所代表的微生物可能也可以與產(chǎn)甲烷菌互營共生降解丙酸.

圖1 丙酸富集前后污泥樣品掃描電鏡圖片

在厭氧生物處理系統(tǒng)中，作為中間代謝產(chǎn)物的丙酸需要在產(chǎn)甲烷菌群的互營作用下轉化為甲烷［1］.因此，對富集前后的微生物樣品也進行了古菌的16S rDNA PCR-DGGE指紋分析(圖2(b))并構建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3(b)).如圖2(b)所示，在丙酸富集培養(yǎng)物中，條帶A1、A2、A3和A4所代表的產(chǎn)甲烷菌為該富集培養(yǎng)物中的優(yōu)勢菌.其中，條帶A1和A2與甲烷絲狀菌Methanosaeta concilii的相似性在98%以上(圖3(b)).M．concilii只能利用乙酸產(chǎn)生甲烷，是厭氧消化系統(tǒng)中優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌之一［13-14］.而條帶A3和A4與甲烷桿菌Methanobacterium beijingense高度相似，該菌只能利用氫氣或甲酸產(chǎn)甲烷［15］.

圖2 丙酸富集前后污泥DGGE指紋分析

圖3 富集培養(yǎng)物中丙酸氧化菌與產(chǎn)甲烷菌的系統(tǒng)發(fā)育關系

2.2 丙酸質(zhì)量濃度對富集培養(yǎng)物降解特性的影響

如圖4所示，在接種生物量(MLVSS)為0.81 g/L的條件下，當丙酸質(zhì)量濃度小于2 000 mg/L時，該富集培養(yǎng)物表現(xiàn)出較強的降解丙酸的能力，在接種后的第8～10 d時，培養(yǎng)液中95%以上的丙酸被轉化.然而，當丙酸質(zhì)量濃度為2 500 mg/L時，富集培養(yǎng)物對丙酸的降解出現(xiàn)了明顯的停滯期.在接種后的前6 d，丙酸降解速率很低，直到第8 d丙酸降解速率才逐步提高，在14 d后培養(yǎng)液中95%的丙酸才被降解.當丙酸質(zhì)量濃度為3 000 mg/L時，該富集培養(yǎng)物對丙酸的降解速率顯著下降，停滯期進一步延長.直到接種后的第14 d，培養(yǎng)液中丙酸質(zhì)量濃度仍然保持在2 000 mg/L以上，丙酸去除率低于35.5%.該結果與Amani等［16］的研究基本一致，Amani等發(fā)現(xiàn)，在丙酸質(zhì)量濃度為2 986 mg/L條件下的丙酸去除率較1 543 mg/L條件下降低了17%［16］.本研究還發(fā)現(xiàn)丙酸質(zhì)量濃度為3 000 mg/L條件下培養(yǎng)14 d后，丙酸降解速率逐漸恢復并在第20 d幾乎降解完畢.

以上結果表明，培養(yǎng)液中較高丙酸質(zhì)量濃度(≥2 500 mg/L)會對系統(tǒng)中丙酸氧化菌群的代謝活性產(chǎn)生抑制作用，導致系統(tǒng)中丙酸去除率明顯下降.另外，在較高的丙酸質(zhì)量濃度下，富集培養(yǎng)物對丙酸的降解具有明顯的停滯期且隨著丙酸質(zhì)量濃度的提高而延長.在較高的丙酸質(zhì)量濃度下，隨著培養(yǎng)液中丙酸質(zhì)量濃度的緩慢下降，丙酸質(zhì)量濃度對互營丙酸氧化菌代謝活性的抑制會逐步解除.由此可見，較高質(zhì)量濃度的丙酸對丙酸氧化菌代謝活性的抑制作用屬于可逆抑制.

為了考察不同丙酸質(zhì)量濃度下，培養(yǎng)液的pH變化可能對丙酸降解產(chǎn)生的抑制作用，對不同丙酸質(zhì)量濃度培養(yǎng)液的pH隨培養(yǎng)時間的變化進行了分析.由圖5可以看出，在整個丙酸降解過程中，各丙酸質(zhì)量濃度下的pH均維持在7.4～7.8.已有研究表明，pH7.4～7.8是多數(shù)丙酸氧化菌最適pH范圍［12，17-18］.由此可見，即使在適宜的pH范圍內(nèi)，較高的丙酸質(zhì)量濃度也會對丙酸氧化菌的代謝活性產(chǎn)生直接的抑制作用.

2.3 累計產(chǎn)甲烷量

在產(chǎn)甲烷環(huán)境中，丙酸的轉化主要依賴丙酸氧化菌群和產(chǎn)甲烷菌群的協(xié)同作用來完成.丙酸氧化菌將丙酸轉化為產(chǎn)甲烷菌可利用的底物乙酸、H2/CO2;反過來，產(chǎn)甲烷菌通過清除丙酸降解的終產(chǎn)物推動丙酸氧化的進行［19］.因此，產(chǎn)甲烷活性的高低對于丙酸的氧化十分重要.如圖6所示，累計產(chǎn)甲烷量的變化趨勢與丙酸降解過程一致.當丙酸質(zhì)量濃度為1 000，1 500和2 000 mg/L時，在培養(yǎng)的前1 d就表現(xiàn)出較高的活性，并且分別在第5、第8、第10天時累計產(chǎn)甲烷量達到最大值.當丙酸質(zhì)量濃度為2 500～3 000 mg/L時，培養(yǎng)前期產(chǎn)甲烷速率較其他實驗組低，隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)逐漸提高.

圖5 不同丙酸質(zhì)量濃度下pH變化

產(chǎn)甲烷菌根據(jù)可利用底物的不同分為嗜氫產(chǎn)甲烷菌和嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌.在整個實驗過程中，幾乎檢測不到H2積累，可見丙酸質(zhì)量濃度的高低對于嗜氫產(chǎn)甲烷菌的活性沒有顯著的影響.當丙酸質(zhì)量濃度為2 500和3 000 mg/L時，乙酸發(fā)生了短暫的積累(圖6)，表明高質(zhì)量濃度的丙酸(＞2 500 mg/L)會對嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌的代謝活性產(chǎn)生抑制作用，且該抑制作用也屬于可逆抑制，而高質(zhì)量濃度的丙酸對嗜氫產(chǎn)甲烷菌代謝活性的影響不顯著.

圖6 不同丙酸質(zhì)量濃度下累計甲烷產(chǎn)量歷時曲線

結合圖4～7可以看出，在pH適宜的條件下，較高質(zhì)量濃度的丙酸會抑制丙酸氧化菌群的活性，同時會對嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌群的活性造成影響.因此，在厭氧消化過程中必須盡可能避免丙酸的積累.另外，在pH適宜的條件下高質(zhì)量濃度丙酸只能在一定程度上抑制丙酸氧化菌群的活性，但不會完全抑制，隨著丙酸質(zhì)量濃度的降低這種抑制會被解除.由此可見，高質(zhì)量濃度的丙酸(＞2 500 mg/L)對互營丙酸氧化菌代謝活性的抑制作用屬可逆抑制.

圖7 不同丙酸質(zhì)量濃度下乙酸的變化

3 結論

1)以ABR反應器第3格室厭氧顆粒污泥為種泥，丙酸為唯一碳源，在35℃條件下經(jīng)過15代的連續(xù)傳代培養(yǎng)，富集到以丙酸氧化菌(Syntrophobacter)和產(chǎn)甲烷菌(Methanosaeta concilii和Methanobacterium beijingense)為優(yōu)勢菌的富集培養(yǎng)物.

2)在中溫(35℃)和中性(pH 7.4)條件下，高質(zhì)量濃度的丙酸(＞2 500 mg/L)會對丙酸氧化菌的代謝活性產(chǎn)生顯著的抑制作用，且該抑制作用屬于可逆抑制.而高質(zhì)量濃度的丙酸對產(chǎn)甲烷菌代謝活性的影響不明顯.

［1］LI J，BAN Q，ZHANG L，et al．Syntrophic propionate degradation in anaerobic digestion:a review［J］.International Journal of Agriculture and Biology，2012，14(5):843-850.

［2］JHA A K，LI J，LORING N，et al．Research advances in dry anaerobic digestion process of solid organic wastes［J］.Africa Journal of Biotechnology，2011，10(65):14242-14253.

［3］INANC B，MATSUIS，IDE S.Propionic acid accumulation and controlling factors in anaerobic treatment of carbohydrate:effects of H2and pH［J］.Water Science and Technology，1996，34:317-325.

［4］任南琪，趙丹，陳曉蕾，等.厭氧生物處理丙酸產(chǎn)生和積累的原因及控制對策［J］.中國科學:B輯，2002，32(2):83-89.

［5］DHAKED R K，WAGHMARE C K，ALAM S I，et al．Effect of propionate toxicity on methanogenesis of night soil at phychrophilic temperature［J］.Bioresource Technology，2003，87:299-303.

［6］ANGELIDAKI I，SANDERS W.Assessment of the anaerobic biodegradability of macropollutants［J］.Reviews in Environmental Science and Biotechnology，2004，3:117-129.

［7］WAN C，DU M，LEE D，et al．Electrokinetic remediation and microbial community shift of βcyclodextrin-dissolved petroleum hydrocarboncontaminated soil［J］.Applied Microbiologyand Biotechnology，2011，89(6):2019-2025.

［8］American Public Health Association.Standard methods for the examination of water and wastewater［M］.Washington，DC:［s.n.］，1995.

［9］OWEN W F，STUCKEY D C，HEALY J B，et al．Bioassay for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity［J］.Water Research，1979，13:485-492.

［10］R.E.斯皮斯，著.工業(yè)廢水的厭氧生物處理技術［M］.李亞新，譯.北京:中國建筑工業(yè)出版社，2001.

［11］BOONE D R，BRYANT M P.Propionate-degrading bacterium，Syntrophobacter woliniisp.nov.gen.nov.，from methanogenic ecosystems［J］.Appliedand Environmental Microbiology，1980，40:626-632.

［12］CHENS，LIUX，DONGX.Syntrophobacter sulfatireducenssp.nov.，anovelsyntrophic，propionate-oxidizing bacterium is olated from UASB reactors［J］.International Journal of System and Evolutionary Microbiology，2005，55:1319-1324.

［13］KEYSER M，WITTHUHN R C，LAMPRECHT C，et al．PCR-based DGGE fingerprinting and identification of methanogens detected in three different types of UASB granules［J］.System and Applied Microbiology，2006，29:77-84.

［14］LIU Y，WHITMAN W B.Metabolic，phylogenetic，and ecological diversity of the methanogenic archaea［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2008，1125:171-189.

［15］MA K，LIU X，DONG X.Methanobacterium beijingensesp.nov.，a novel methanogen isolated from anaerobic digesters［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55(1):325-329.

［16］AMANI T，NOSRATI M，MOUSAVI S M，et al．Study of syntrophic anaerobic digestion of volatile fatty acids using enriched cultures at mesophilic conditions［J］.International Journal of Environmental Scienceand Technology，2011，8:83-96.

［17］WALLRABENSTEIN C，HAUSCHILD E，SCHINK B.Syntrophobacter pfennigiisp.nov.，new syntrophically propionate-oxidizing anaerobe growing in pure culture with propionate and sulfate［J］.Archives of Microbiology，1995，164:346-352.

［18］HARMSEN H J M，KUIJK van B L M，PLUGGE C M，et al．Syntrophobacter fumaroxidanssp.nov.，a syntrophic propionate-degrading sulfate-reducing bacterium［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1998，48:1383-1387.

［19］WORM P，STAMS A J M，CHENG X，et al．Growth and substrate-dependent transcription of for mate dehydrogenase and hydrogenase coding genes inSyntrophobacter fumaroxidansandMethanospirillum hungatei［J］.Microbiology，2011，157:280-289.