高三尖杉酯堿對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

黃海進(jìn)，何秀芝，焦峰

(中國(guó)人民解放軍第82醫(yī)院，江蘇淮安 223001)

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)，胃癌發(fā)病率位于惡性腫瘤的第2位，死亡率位于第3位［1］，并且現(xiàn)在胃癌發(fā)病年齡逐漸年輕化，對(duì)人們的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。胃癌有效的治療方法仍以外科手術(shù)為主，目前我國(guó)就診的胃癌患者中大多屬于中晚期，手術(shù)切除率僅為50%左右，術(shù)后5年生存率僅有20%～30%［2］，故術(shù)后化療顯得尤為重要。因胃癌發(fā)生、發(fā)展與飲食因素關(guān)系密切，所以尋找天然植物治療胃癌具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。目前，臨床上用于治療腫瘤的植物藥已篩選出20余種，包括生物堿、木脂素、柄型大環(huán)化合物、二萜類(lèi)化合物等，其中紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等藥物已經(jīng)在臨床上大量使用。高三尖杉酯堿(homoharringtonine，HHT)是從粗榧屬植物中提取的一種生物堿，是我國(guó)自主研制成功的高效抗腫瘤藥物，目前臨床主要用于急性髓系白血病、慢性粒細(xì)胞白血病和骨髓增生異常綜合征的治療［3-4］。之前的研究顯示，HHT治療腫瘤的主要機(jī)制是抑制腫瘤DNA及蛋白質(zhì)合成、抑制腫瘤細(xì)胞與纖維蛋白原的結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［5］。HHT抗胃癌作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)觀察HHT對(duì)體外培養(yǎng)的人SGC-7901胃癌細(xì)胞株的抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，以探求治療胃癌的新藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SGC-7901細(xì)胞由上海腫瘤研究所提供，RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibeo公司，胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自杭州四季青公司，胰蛋白酶購(gòu)自北京華邁科生物技術(shù)公司，乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自上海永葉生物科技公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿均購(gòu)自德國(guó)Corning公司，Annexin V·FITC/PI試劑盒購(gòu)自上海晶美生物公司;CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma Scientific公司，酶標(biāo)測(cè)定儀購(gòu)自南京萊步科技公司，F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d換液1次，7～10 d后用2.5 g·L－1的胰蛋白酶消化傳代1次。據(jù)HHT濃度分為空白對(duì)照組和HHT小、中、大劑量組(劑量依次為 20、80、120 μg·ml－1)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞用胰蛋白酶加EDTA消化并稀釋成(4.0～5.0)×104ml－1的活細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，于24 h后補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基80 μl并加入不同濃度的藥物20 μl，使HHT終濃度分別為20、80、120 μg·ml－1，空白對(duì)照組加入20 μl完全培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間，吸棄舊培養(yǎng)液，加入5 mg·ml－1的MTT 15 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸棄全部上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩后于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定用藥后24、48、72 h各孔光密度(OD)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:抑制率(%)=

1.2.3 細(xì)胞周期及凋亡率分析 以上終濃度的HHT分別作用SGC-7901細(xì)胞24 h后，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。離心棄上清，用0.1 mol·L－1、pH 7.4的PBS洗滌3次。將細(xì)胞沉淀充分混勻，用預(yù)冷的75%乙醇固定，4℃過(guò)夜。PBS洗脫乙醇后加入10 μl RNA酶和10 μl PI，4℃避光染色。30 min后用FACScalibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化，ModFit LT V 3.0軟件分析細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HHT 在 20、80、120 μg·mL－1濃度下與空白對(duì)照組比較，作用24、48、72 h均能呈現(xiàn)一定的劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，見(jiàn)表1和圖1。

表1 不同濃度HHT作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞不同時(shí)間平均OD值比較± s，n=3)

表1 不同濃度HHT作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞不同時(shí)間平均OD值比較± s，n=3)

HHT/μg·ml－1 平均 OD值24 h 48 h 72 h 0 0.354±0.003 0.763±0.013 0.969±0.009 20 0.321±0.007 0.671±0.010 0.700±0.010 80 0.288±0.010 0.574±0.013 0.571±0.011 120 0.247±0.006 0.494±0.088 0.401±0.014

2.2 HHT對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響

不同濃度的HHT分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P＞0.05)，G2/M期細(xì)胞比例呈藥物劑量依賴(lài)性增加，不同濃度HHT組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2、圖2)，S期細(xì)胞比例逐漸降低(P＜0.05)，表明存在 G2/M期阻滯。

圖1 不同濃度HHT作用不同時(shí)間后SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的變化

表2 不同濃度HHT分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后不同細(xì)胞周期比例± s，n=3)

表2 不同濃度HHT分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后不同細(xì)胞周期比例± s，n=3)

注:不同濃度HHT組S期與G2/M期細(xì)胞百分率之間比較，P＜0.05

HHT/μg·ml－1 細(xì)胞周期比例/%G0/G1 S G2/M 0 46.9±0.89 52.04±0.33 1.06±0.72 20 46.57±0.88 49.19±0.76 4.24±1.61 80 44.28±0.41 42.36±0.58 13.36±0.98 120 47.03±0.35 31.27±0.32 21.7±0.66

圖2 不同濃度HHT作用SGC-7901細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期及凋亡流式細(xì)胞圖

3 討 論

目前對(duì)胃癌的治療手段中化學(xué)治療處于極其重要的地位。但大多數(shù)藥物使用后病人會(huì)有一定的不良反應(yīng)，因此尋找安全有效的抗腫瘤治療藥物是一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題［6］。

HHT來(lái)源豐富，可通過(guò)三尖杉屬植物的莖、葉、根、果皮經(jīng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)或組織培養(yǎng)和次級(jí)培養(yǎng)，也可以從含有HHT的植物材料或培養(yǎng)細(xì)胞或植物組織經(jīng)溶媒提取、分離、精制得到，還可以從提取過(guò)的三尖杉屬植物的殘?jiān)薪?jīng)半合成方法獲得［7］。

HHT能抑制真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，使多聚核糖體解聚，干擾蛋白核體糖功能，對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的合成亦有抑制作用［8-9］。研究顯示HHT對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，尤其用于急性淋巴細(xì)胞或慢性粒細(xì)胞白血病有較好的療效［10-11］。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程，如果細(xì)胞周期某一時(shí)相出現(xiàn)異常，細(xì)胞將進(jìn)入病理過(guò)程。藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用與干擾細(xì)胞增殖周期、抑制細(xì)胞周期間的正常轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞向凋亡通路發(fā)展有關(guān)。我們采用流式細(xì)胞儀分析HHT作用后SGC-7901胃癌細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示HHT能夠誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)劑量依賴(lài)性的G2/M期阻滯。細(xì)胞凋亡圖上呈現(xiàn)出隨藥物濃度增加而逐步增高的凋亡峰。HHT通過(guò)將SGC-7901胃癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，干擾細(xì)胞各生長(zhǎng)周期間的正常轉(zhuǎn)化，從而以劑量依賴(lài)性方式增加亞“G1”期凋亡峰，減慢細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HHT對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡完成的。

本實(shí)驗(yàn)證明，HHT在體外可抑制人SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖，其抑制率隨著劑量的增加而升高，且HHT在一定劑量下能誘導(dǎo)人SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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